陳小玲 王 歡 黃志清 周 波 賈 剛 劉光芒 趙 華

(四川農(nóng)業(yè)大學動物營養(yǎng)研究所，動物抗病營養(yǎng)教育部重點實驗室，成都 611130)

磷酸酪氨酸互作結構域1(phosphotyrosine interaction domain containing 1，PID1)基因是 Wang等［1］于2006年采用抑制性消減雜交技術篩選肥胖與正常人腹膜脂肪組織后而獲得的新基因。該基因最先命名為NYGGF4基因，后根據(jù)該基因的結構特征被國際統(tǒng)一命名為PID1基因。基于生物信息學分析，發(fā)現(xiàn)PID1蛋白序列中存在磷酸酪氨酸作用位點(PTB)，該位點與胰島素受體底物-1(IRS1)的結構相似，參與胰島素信號途徑的調節(jié)和生長因子刺激下細胞增殖等下游效應［2］。生物學功能研究表明，PID1與胰島素抵抗和人類肥胖病的發(fā)生密切相關［1，3］。另有研究表明，PID1 基因在鼠脂肪組織中也呈高水平表達［4］，在脂肪細胞增殖和分化成熟過程中其表達也逐漸上調［1，5］。此外，PID1基因在體外過表達能顯著促進小鼠3T3-L1脂肪前體細胞的增殖和脂肪細胞數(shù)目的增多［1-2］，而脂肪細胞過度增殖是脂肪沉積發(fā)生的重要環(huán)節(jié)［6］。前人對PID1基因的研究主要以人和鼠為對象，對豬PID1基因的研究較少。錢源等［7］首次采用簡并引物克隆到豬PID1基因的編碼序列(CDS)，蛋白結構域分析發(fā)現(xiàn)該序列C端也含有一PTB結構域，與IRS1中PTB結構域的結構相似，提示其可能有相似的功能［7］。組織表達規(guī)律研究表明，豬PID1基因呈多組織表達特性，并在豬的肝臟中表達量最高，其次為脂肪和肌肉組織［7-8］。PID1基因在地方品種豬萊蕪豬和魯萊黑豬中的表達均顯著高于大白豬［7］，而萊蕪豬和魯萊黑豬肌內脂肪含量顯著高于大白豬［9］。相關性分析結果表明，肌肉組織中PID1基因表達量與豬肌內脂肪含量呈顯著正相關［7］，且萊蕪豬PID1基因與肌內脂肪含量的相關性高于過氧化物酶體增殖物激活受體 γ(PPARγ)［10］。另有研究表明，過表達豬PID1能顯著促進3T3-L1前體脂肪細胞的增殖，而對其分化影響差異不顯著［11］。上述結果提示，PID1基因能影響脂肪沉積并與豬肌內脂肪含量間存在一定的關聯(lián)性，可能為影響豬肌內脂肪沉積的候選基因［10，12］。目前對豬 PID1基因的功能和組織表達規(guī)律研究僅限于在其mRNA水平上研究。因此，為從蛋白質水平上鑒定豬PID1的功能，豬PID1蛋白的抗體制備就顯得非常必要。本研究旨在利用原核表達系統(tǒng)制備重組豬PID1蛋白，并采用鎳離子-亞氨基二乙酸(Ni2+-IDA)親和層析柱對其進行純化，純化的蛋白采用十二烷基硫酸鈉-變性梯度凝膠電泳(SDS-PAGE)和基質輔助激光解析電離飛行時間質譜(MALDI-TOFMSMS)進行鑒定，同時制備豬pPID1的多克隆抗體，為深入研究豬pPID1的功能及豬PID1的檢測提供試驗材料。

1 材料與方法

1.1 試驗動物、菌株及質粒

SD雄性大鼠2只，購自成都達碩有限公司。大腸桿菌原核表達載體pET28a(+)為本實驗室保存，大腸桿菌DH5α、大腸桿菌BL21購自天根生化科技(北京)有限公司。

1.2 主要試劑

2×Taq PCR Master Mix、DNA 分子質量標準購自天根生化科技(北京)有限公司;限制性內切酶EcoRⅠ、HindⅢ、連接溶液(ligation solution，溶液Ⅰ)、蛋白質分子質量標準購自TaKaRa公司;SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒購自生工生物工程(上海)股份有限公司;質粒小量提取試劑盒(E.Z.N.ATMPlasmid Mini KitⅠ)購自美國 OMEGA公司;Ni2+-IDA層析柱購自美國BBI公司;異丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)購自碧云天生物技術有限公司;二辛可寧酸(BCA)法蛋白質濃度測定試劑盒購自美國Pierce公司;弗氏完全佐劑和弗氏不完全佐劑購自美國MP Biomedicals公司;辣根過氧化酶標記羊抗大鼠IgG購自美國Santa Cruz Biotechnology公司;酵母提取物和蛋白胨為英國Oxoid公司產(chǎn)品。其他試劑均為分析純。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.3 原核表達載體的構建

1.3.1 引物的合成及載體構建

根據(jù)豬PID1基因序列(GenBank登錄號KC524726)和原核表達載體pET28a(+)的多克隆位點設計引物擴增豬PID1基因編碼區(qū)序列，引物由上海生工生物工程有限公司合成。上游引物PIDxR-F的核苷酸序列為:5'-CGGAATTCATGTGGCAGCCG-3'，含 EcoRⅠ酶切位點;下游引物PIDxh-R的核苷酸序列為:5'-CCCAAGCTTTCAGCCATCATCG-3'，含 HindⅢ酶切位點。PCR體系中的模板為本實驗室構建的重組質粒 pcDNA3.1(+)-PID1［11］1 μL，上、下游引物(10μmol/L)各 1 μL，2×Taq PCR MasterMix 25μL，加滅菌水至總體積50μL。PCR擴增條件為:94℃變性5 min;然后94℃ 30 s，62℃ 30 s，72℃ 45 s，共35個循環(huán);最后72℃延伸10 min，反應結束后，立即進行電泳。對擴增的PCR產(chǎn)物采用SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒進行切膠回收。應用EcoRⅠ和HindⅢ對回收的PCR產(chǎn)物和原核表達載體pET28a(+)進行雙酶切，然后對酶切產(chǎn)物進行膠回收和1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。根據(jù)目的片段與載體物質的量比為(1∶10)～(1∶2)的原則，對切膠回收的PCR產(chǎn)物和表達載體進行連接反應。連接反應體系為10μL，其中雙酶切的豬 PID1基 因 PCR產(chǎn) 物 4.5μL、雙 酶 切 的pET28a(+)表達載體 0.5 μL、溶液Ⅰ 5 μL，條件為16℃連接4 h。

1.3.2 重組載體的鑒定

將pET28a(+)-pPID1加入到80μL大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞中，混勻，冰中靜置 30 min，42℃水浴熱激90 s，在無抗 LB液體培養(yǎng)基中37℃復蘇細菌，將細菌涂于含卡那霉素(Kan)的LB固體培養(yǎng)板中，37℃恒溫培養(yǎng)16 h出現(xiàn)菌落，挑取菌落進行菌落PCR鑒定，具體方法如下:用滅菌的牙簽挑取少量單菌落至含10μL滅菌水的PCR管中，于PCR儀上95℃變性5 min，然后進行PCR分析，體系中加入 PIDxR-F 0.5μL、PIDxh-R 0.5 μL、2×Taq PCR MasterMix 12.5 μL、滅菌水1.5μL，總體積 25μL。PCR 條件為:94℃ 30 s，62℃ 30 s，72℃ 45 s，共35個循環(huán);最后72℃延伸10 min，反應結束后，立即進行電泳。對有插入片段的陽性克隆進行測序［由生工生物工程(上海)股份有限公司完成］。

1.4 融合蛋白的誘導表達及純化

提取構建成功的重組菌的質粒，轉化大腸桿菌BL21感受態(tài)細胞。挑取單菌落于LB液體培養(yǎng)基中，37℃搖床培養(yǎng)過夜，按1%轉接到新鮮LB液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)至 OD600nm約為0.4～0.6時加入IPTG進行誘導表達。IPTG濃度設定4個梯度(0.1、0.5、1.0、2.0 mmol/L)、溫度設 2 個梯度(30、37 ℃)、誘導時間設 5 個梯度(1、2、3、4 和5 h)。誘導表達后10 000 r/min離心1 min收集菌體，加入 70μL 1×蛋白質上樣緩沖液，煮沸10 min，十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)鑒定融合蛋白的表達。同時將誘導的菌體4℃ 10 000 r/min離心1 min，將菌體用磷酸鹽緩沖液(PBS，pH 7.4)重懸后于冰上進行超聲裂解細菌細胞。4℃ 6 000 r/min離心10min，棄去沉淀;上清轉移到1個新的離心管中，12 000 r/min離心15 min;分別取離心后得到的上清和沉淀進行SDS-PAGE分析。電泳后，經(jīng)考馬斯亮藍染色，甲醇-冰乙酸脫色液脫色觀察結果。

按照美國BBI公司的Ni2+-IDA親和層析柱說明書進行蛋白的純化。將純化后的包涵體蛋白經(jīng)SDS-PAGE鑒定。同時將表達的目的蛋白條帶切下后送往復旦大學生命科學院進行MALDI-TOFMSMS鑒定。采用BCA法蛋白質濃度測定試劑盒測定純化后蛋白的濃度。

1.5 多克隆抗體的制備

用純化的pPID1融合蛋白常規(guī)免疫SD大鼠，每次免疫劑量200μg，溶于PBS中。首次免疫，將純化得到的豬PID1蛋白與等體積的弗氏完全佐劑混合乳化，對SD大鼠背部皮下多點注射。2周后以同樣的抗原劑量與等體積的弗氏不完全佐劑混合免疫。此后每隔10 d進行加強免疫1次，共加免3次。最后1次免疫后7天摘眼球采血，制備血清。SD大鼠免疫前進行尾根斷尾取血清作為陰性對照。

1.6 抗體效價的測定

間接酶聯(lián)免疫分析(ELISA)方法檢測抗體效價，參照文獻［13］所述的方法做了適當修改。用包被緩沖液將純化的pPID1融合蛋白稀釋至2.5 μg/mL，按照 100 μL/孔的量包被到聚苯乙烯反應(PVC)板上，4℃包被過夜;用 PBS-T(含0.01%吐溫-20和0.1%明膠的 PBS)洗滌 3次，然后每孔加150μL封閉液;用PBS-T洗滌3次，每孔加 100 μL 倍比稀釋(1∶1 280、1∶2 560、1∶5 120、1∶10 240、1∶20 480 和 1∶40 960)的免疫血清，以免疫前大鼠的血清作為陰性對照，每個樣品設2個重復孔，37℃溫育1 h，用PBS-T洗滌3次，每孔加100μL PBS-T稀釋的二抗［辣根過氧化物酶標記的羊抗大鼠免疫球蛋白G(IgG)，1∶5 000稀釋］，37℃溫育 1 h;用PBS-T洗滌3次，加入100μL底物顯色劑鄰苯二胺(OPD)，37 ℃ 溫育 15～30 min，用 50 μL 2 mol/L的硫酸終止反應;用酶標儀測定波長490 nm處的吸光度值(OD490nm)，若待測孔OD490nm大于或等于陰性對照孔的2.1倍，即認為是陽性值，從而得出血清的抗體效價。

1.7 抗體特異性的檢測

將純化的pPID1融合蛋白及空載體pET28a(+)表達蛋白樣品進行SDS-PAGE后，進行蛋白質免疫印跡(Western blot)分析，用半干法電轉移到硝酸纖維素(NC)膜上，5%脫脂奶粉封閉后，以本試驗制備的大鼠抗血清(1∶2 000)為一抗，辣根過氧化物酶標記的羊抗大鼠IgG(1∶5 000)為二抗進行反應。顯色反應參照美國Pierce公司的化學發(fā)光底物說明書進行。

2 結果

2.1 重組質粒的鑒定

EcoRⅠ和HindⅢ雙酶切后的豬PID1基因和表達載體pET28a(+)經(jīng)連接、轉化后獲得的重組質粒進行PCR擴增，1.5%瓊脂糖凝膠電泳(圖1)顯示擴增片段大小約650 bp，與目的基因片段大小一致。進一步的測序結果表明，所構建的表達質粒完全正確(測序數(shù)據(jù)略)，將其命名為pET28a(+)-pPID1。

2.2 融合蛋白的表達和純化

重組原核表達質粒pET28a(+)-pPID1化學法轉化到大腸桿菌BL21感受態(tài)細胞中，經(jīng)IPTG誘導后菌體超聲破碎，取上清和沉淀分別進行12%的SDS-PAGE，所表達的融合蛋白主要存在于沉淀中，證明pPID1融合蛋白是以包涵體形式存在。試驗中IPTG濃度設置了4個梯度，溫度設置了2個梯度，誘導時間設置了6個梯度，IPTG濃度對pPID1融合蛋白表達量影響不大(圖略)，溫度和時間分別以30℃和4 h時pPID1融合蛋白表達量最高(圖2)。

圖1 重組質粒p ET28a(+)-p PID1的PCR分析Fig.1 PCR analysis of recombinant plasmid pET28a(+)-pPID1

如圖3所示，經(jīng)SDS-PAGE檢測，表達產(chǎn)物經(jīng)Ni2+-IDA親和層析純化后僅見單一的蛋白質條帶。經(jīng)測定，純化后得到的融合蛋白濃度為1.6 mg/mL。對純化的蛋白質進行MALDI-TOFMSMS鑒定，結果表明，共有8個肽段與目的蛋白吻合(圖4)，且鑒定蛋白質的分子質量為28 622 u，與重組蛋白的理論分子質量相符，證明所純化的蛋白為pPID1。

2.3 抗體效價

加強免疫后的SD大鼠摘眼球采血，并立即將血液放室溫1 h，然后取出放入4℃冰箱過夜，制備抗血清，-20℃保存?zhèn)溆谩２捎瞄g接ELISA測定pPID1多克隆抗體效價，以免疫pPID1融合蛋白前的SD大鼠血清為陰性對照，結果表明，經(jīng)4次免疫后，抗體效價為1∶20 480(圖5)。

圖2 重組pPID1在大腸桿菌中表達的最適誘導條件Fig.2 Optimal induction conditions for the expression of recombinant pPID1 in E.coli

2.4 抗體免疫原性

對純化的pPID1融合蛋白及空載體pET28a(+)表達蛋白樣品進行SDS-PAGE，將凝膠上的目的蛋白采用半干法電轉移到NC膜上，并對NC膜進行封閉、一抗、二抗孵育，然后用化學發(fā)光底物進行顯色，結果僅見1條反應帶，而空載體pET28a(+)表達蛋白樣品所作的Western blot分析未見任何條帶(圖6)，這表明本試驗制備的多克隆抗體具有很好的免疫反應性和蛋白特異性，同時也證實了在大腸桿菌中成功表達了pPID1融合蛋白。

3 討論

本試驗采用pET28a(+)原核表達載體表達pPID1。pET28a(+)表達載體是原核表達常用的載體，其大小為5 369 bp，含有強有力的T7啟動子、卡那霉素抗性基因和便于純化的N端和C端的組氨酸標簽(His-Tag)，能被IPTG誘導表達。本試驗采用不同的IPTG濃度、不同的誘導溫度和誘導時間優(yōu)化pPID1的表達條件，結果表明，pPID1的最適表達條件為IPTG濃度為0.1 mmol/L，誘導溫度為30℃，誘導時間為4 h。本試驗表達蛋白N端融合了由6個組氨酸串聯(lián)的His-Tag，這為目的蛋白的純化提供了方便，使純化過程簡單，因此可利用親和層析進行分離純化。表達產(chǎn)物經(jīng)Ni2+-IDA親和層析柱純化后，SDSPAGE分析可見單一的蛋白條帶。

圖3 純化的p PID1融合蛋白的SDS-PAGE分析Fig.3 Analysis of SDS-PAGE of purified fusion protein pPID1

圖4 純化的pPID1融合蛋白的MALDI-TOF-MSMS鑒定Fig.4 MALDI-TOF-MSMS identification of purified fusion protein pPID1

生物質譜，尤其是MALDI-TOF-MS是近年來發(fā)展起來的一種新型的軟電離生物質譜，能通過離子的質量電荷之比(m/Z)與離子的飛行時間成正比來分析離子，并測得樣品分子的分子質量，目前已用于原核表達和真核表達蛋白的鑒定［14-15］。從SDS-PAGE結果來看，該蛋白質分子質量約為32 ku，而pPID1基因片段實際大小為654 bp，共編碼217個氨基酸，與載體pET28a(+)連接后該基因的上游多融合36個氨基酸。因此，加上這一段融合的氨基酸，預測分子質量約為29 ku，而表達的融合蛋白約為32 ku，兩者相差約3 ku。本研究采用了MALDI-TOF-MS對原核表達pPID1重組蛋白進行了鑒定，分子質量為28 622 u，與重組蛋白的理論分子質量相符，證實了表達目的蛋白的正確性。

圖5 間接ELISA法測定豬PID1多克隆抗體效價Fig.5 Antibody titer of polyclonal antibody of porcine PID1 determined by indirect ELISA

圖6 pPID1融合蛋白的Western blot分析Fig.6 Western-blot analysis of fusion protein pPID1

用純化的pPID1融合蛋白免疫SD大鼠制備抗pPID1多克隆抗體。經(jīng)間接ELISA檢測表明，抗pPID1的抗體效價高達1∶20 480;利用Western blot方法檢測表明，所獲得的多克隆抗體能與pPID1融合蛋白特異性結合。因此本試驗所獲得的pPID1融合蛋白可為今后研究其功能提供了試驗材料，且所獲得的多克隆抗體也可用于檢測pPID1表達等相關試驗，同時為從蛋白水平檢測pPID1基因調控豬肌內脂肪沉積奠定了良好的工作基礎。

4 結論

本試驗成功實現(xiàn)了pPID1基因在大腸桿菌中的表達，同時表達產(chǎn)物經(jīng)Ni2+-IDA親和層析柱純化后得到了純度較高的pPID1融合蛋白，該蛋白經(jīng)MALDI-TOF-MS鑒定為 pPID1。以純化的pPID1融合蛋白作為抗原免疫SD大鼠，經(jīng)間接ELISA和Western blot檢測，獲得了具有較高抗體效價且特異性良好的pPID1多克隆抗體。

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