吳小燕 彭全輝 王之盛* 鄒華圍 陳 慧 唐春梅

(1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動物營養(yǎng)研究所，雅安 625014;2.樂至縣天龍農(nóng)牧科技有限公司，樂至 641507)

蛋白質(zhì)飼料是反芻動物飼糧中最主要的氮源，但是我國蛋白質(zhì)飼料資源十分緊張，估計2020年我國蛋白質(zhì)飼料的供需缺口將達(dá)到0.48億t［1］。高效合理地利用蛋白質(zhì)飼料資源可在一定程度上緩解蛋白質(zhì)飼料資源緊張的局面。反芻動物是主要的粗飼料利用者，其飼糧主要依靠瘤胃微生物來消化，瘤胃中存在的細(xì)菌、真菌及原蟲均具有分解利用纖維物質(zhì)的能力，在纖維物質(zhì)的分解利用過程中細(xì)菌和真菌發(fā)揮了80%的作用，原蟲起平衡控制作用［2］。產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌、黃色瘤胃球菌和白色瘤胃球菌是3種主要的瘤胃纖維素分解菌［3］。調(diào)控瘤胃微生物是提高飼料的利用率、緩解蛋白質(zhì)飼料資源短缺、提高經(jīng)濟(jì)效益的有效途徑之一。而前人對瘤胃微生物的研究中，在飼糧方面主要是針對精粗比［4－7］和粗飼料［8－10］不同的研究，對精料中蛋白質(zhì)飼料不同對瘤胃纖維降解微生物的影響方面的研究較少。瘤胃微生物在瘤胃內(nèi)主要是存在于瘤胃液、附著于瘤胃內(nèi)壁上和黏附于飼料顆粒上［11］。大量研究表明，瘤胃固相微生物數(shù)量高于瘤胃液，是瘤胃中主要的功能微生物［6，9－10，12］。因此，研究不同蛋白質(zhì)飼料對宣漢黃牛瘤胃固相黏附纖維降解微生物的影響顯得非常重要。豆粕、菜籽粕和棉籽粕是我國經(jīng)常使用的植物性蛋白質(zhì)飼料。本試驗(yàn)選用這3種蛋白質(zhì)飼料等量替代基礎(chǔ)飼糧中15%精料來飼喂宣漢黃牛，研究瘤胃固相黏附纖維降解微生物數(shù)量的變化，旨在為更好地調(diào)控瘤胃微生物，提高飼料的利用率提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與設(shè)備

菜籽粕、棉籽粕、豆粕及其他飼料原料均來自四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動物營養(yǎng)研究所試驗(yàn)基地;TIANamp Stool DNA Kit、RNaseA(100 mg/mL)、DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)、6×DNA上樣緩沖液、DNase/RNase-free ddH2O、SuperReal PreMix Plus(SYBR Green)均購自TIANGEN(北京)公司。主要設(shè)備有熒光定量 PCR儀(CFX96TM，美國 Bio-Rad)、凝膠成像系統(tǒng)(美國Syngene)、核酸蛋白檢測儀(DU-800，美國 Beckman)。

1.2 試驗(yàn)動物和試驗(yàn)設(shè)計

選用四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動物營養(yǎng)研究所試驗(yàn)基地4頭體況良好，裝有永久性瘤胃瘺管的4歲去勢宣漢黃牛［平均體重(455.45±18.93)kg］。采用4×4的拉丁方設(shè)計，共4期，每期10 d(預(yù)飼7 d，采樣3 d)。基礎(chǔ)飼糧參考我國《肉牛飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)》(NY/T 815—2004)設(shè)計，1.3 倍維持需要，精粗比為 4∶6，基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平見表1，基礎(chǔ)組飼喂基礎(chǔ)飼糧。試驗(yàn)組分別飼喂以豆粕(豆粕組)、棉籽粕(棉籽粕組)和菜籽粕(菜籽粕組)等量替換基礎(chǔ)飼糧中的精料(替換比例為基礎(chǔ)飼糧的15%)的試驗(yàn)飼糧，其營養(yǎng)水平見表2?；A(chǔ)組、豆粕組、菜籽粕組和棉籽粕組每頭牛飼喂量分別為 7.35、6.93、7.19和 6.99 kg/d(干物質(zhì)基礎(chǔ))，平均分成 2 次定時(07:00和17:00)定量飼喂，拴系飼養(yǎng)，自由飲水。

參考張麗英［13］的方法測定飼糧干物質(zhì)(DM)和粗蛋白質(zhì)(CP)含量。按照Van Soest等［14］的方法測定飼糧中性洗滌纖維(NDF)、酸性洗滌纖維(ADF)和酸性洗滌木質(zhì)素(ADL)含量。采用高錳酸鉀法間接測定飼糧鈣(Ca)含量，采用鉬酸鹽法［15］測定飼糧總磷(TP)含量。

表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))Table 1 Composition and nutrient levels of the basal diet(air-dry basis) %

表2 試驗(yàn)飼糧營養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))Table 2 Nutrient levels of experimental diets(air-dry basis) %

1.3 樣品采集

3 d采樣時間分別為第1天08:00和14:00，第2天10:00和 16:00，第 3天 12:00，即采食后1、3、5、7和9 h。在每頭牛的瘤胃內(nèi)分別取上、下、左、右、中5個位置的瘤胃內(nèi)容物約200 g，并用4層紗布過濾分離出固相樣品，裝入無菌封口袋中，樣品于－80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 測定指標(biāo)及方法

1.4.1 瘤胃固相微生物總DNA的提取

將瘤胃固相樣品4℃解凍后，參考Kang等［16］和Laure等［17］的方法洗脫固相黏附微生物。取1 g樣品于滅菌10 mL離心管中，加入5 mL磷酸鹽緩沖液懸浮，混勻30 s，350×g室溫離心15 min，取上清于一新的滅菌離心管。再向殘?jiān)糠旨尤? mL厭氧條件下制備的0.15%(V/V)吐溫80，充分混勻后在冰上放置 2.5 h，350×g室溫離心15 min，取上清于前一離心管，10 000×g 4℃離心20 min，去上清留沉淀。然后使用TIANamp Stool DNA Kit試劑盒提取微生物總DNA。用核酸蛋白檢測儀測定提取的總DNA的濃度及OD260nm/OD280nm。于－20℃保存。

1.4.2 瘤胃固相微生物數(shù)量的測定

采用熒光定量PCR技術(shù)測定各組飼喂后1、3、5、7和9 h宣漢黃牛瘤胃固相黏附纖維降解微生物相對于瘤胃總菌的數(shù)量。引物序列及參數(shù)見表3，引物由上海華大生物技術(shù)有限公司合成。反應(yīng)體系為15 μL:2×SuperReal PreMix Plus 7.5 μL，上、下游引物(10μmol/L)各 0.45 μL，總 DNA 溶液0.6 μL，RNase-free ddH2O 6 μL。擴(kuò)增條件為:95℃預(yù)變性15 min，95℃變性10 s，相應(yīng)的退火溫度30 s，共40個循環(huán)。自動檢測熒光強(qiáng)度。擴(kuò)增反應(yīng)的特異性通過對PCR終產(chǎn)物制作熔解曲線來確定，方法為:從65℃升溫到95℃，每隔5 s升高0.5℃，儀器自動繪制熔解曲線。熒光定量PCR產(chǎn)物采用2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。

表3 引物序列及參數(shù)Table 3 Sequences and parameters of primers

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

根據(jù)Chen等［23］的方法將微生物數(shù)量表示為相對于總菌16S rDNA的百分比，公式如下:

目標(biāo)微生物(%)=2－(Ct目標(biāo)微生物－Ct總菌)×100。

式中:Ct為閾值循環(huán)。

試驗(yàn)結(jié)果用Excel 2007進(jìn)行預(yù)處理，用SPSS 18.0統(tǒng)計軟件對結(jié)果進(jìn)行單因素方差分析，采用Duncan氏法多重比較檢驗(yàn)，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示(P＜0.05 表示差異顯著，P＜0.01 表示差異極顯著)。

2 結(jié)果

2.1 總DNA提取結(jié)果和引物特異性

提取的總 DNA OD260nm/OD280nm在 1.6～1.9，說明得到的總DNA能夠很好地應(yīng)用于后面的熒光定量PCR擴(kuò)增試驗(yàn)。瘤胃固相黏附纖維降解微生物熒光定量PCR產(chǎn)物電泳檢測結(jié)果見圖1，擴(kuò)增條帶清晰且無拖帶現(xiàn)象，擴(kuò)增片段長度與文獻(xiàn)報道基本一致。這說明所采用的引物有很高的特異性，擴(kuò)增體系沒有被污染，擴(kuò)增條件和參數(shù)適宜。

圖1 瘤胃固相黏附纖維降解微生物熒光定量PCR產(chǎn)物電泳檢測結(jié)果Fig.1 Electrophoresis results of products of fluorescent quantitation PCR of cellulosis microbes adherent to solid fractions in rumen

2.2 不同蛋白質(zhì)飼料對瘤胃固相黏附微生物數(shù)量的影響

由表4可知，隨著采食時間的延長，基礎(chǔ)組和菜籽粕組真菌數(shù)量變化趨勢相似，均呈現(xiàn)降低－升高－降低－升高的趨勢。各組原蟲、白色瘤胃球菌、黃色瘤胃球菌、產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌數(shù)量的變化趨勢各不相同。

2.2.1 真菌

基礎(chǔ)組、菜籽粕組、豆粕組和棉籽粕組的真菌數(shù)量分別在采食后9、5、5和7 h時達(dá)到最大值。除采食后5 h外其余各時間點(diǎn)組間差異顯著(P＜0.05)。其中，采食后1 h，豆粕組真菌的數(shù)量顯著低于其余各組(P＜0.05)。采食后3和9 h，3個試驗(yàn)組均顯著低于基礎(chǔ)組(P＜0.05)。采食后7 h，棉籽粕組顯著高于菜籽粕組(P＜0.05)，極顯著高于豆粕組和基礎(chǔ)組(P＜0.01)，菜籽粕組顯著高于豆粕組和基礎(chǔ)組(P＜0.05)。從各組平均值來看，基礎(chǔ)組和棉籽粕組均顯著高于菜籽粕組和豆粕組(P＜0.05)。

2.2.2 原蟲

基礎(chǔ)組、菜籽粕組、豆粕組和棉籽粕組的原蟲數(shù)量分別在采食后3、3、7和9 h時達(dá)到最大值。采食后1和3 h，菜籽粕組原蟲的數(shù)量顯著或極顯著高于其余3組(P＜0.05或 P＜0.01)。采食后 5和7 h，各試驗(yàn)組都顯著高于基礎(chǔ)組(P＜0.05)。采食后9 h，棉籽粕組顯著高于菜籽粕組(P＜0.05)，極顯著高于豆粕組和基礎(chǔ)組(P＜0.01)，菜籽粕組顯著高于豆粕組和基礎(chǔ)組(P＜0.05)。從各組平均值來看，菜籽粕組原蟲數(shù)量顯著高于豆粕組和棉籽粕組(P＜0.05)、極顯著高于基礎(chǔ)組(P＜0.01)。

2.2.3 白色瘤胃球菌

基礎(chǔ)組和棉籽粕組的白色瘤胃球菌數(shù)量在采食后7 h時達(dá)到最大值，菜籽粕組和豆粕組在采食后5 h時達(dá)到最大值。采食后1 h，菜籽粕組白色瘤胃球菌的數(shù)量顯著高于其余3組(P＜0.05)。采食后3 h，棉籽粕組顯著高于菜籽粕組和基礎(chǔ)組(P＜0.05)。采食后5 h，豆粕組顯著高于菜籽粕組和棉籽粕組(P＜0.05)。采食后7 h，棉籽粕組顯著高于菜籽粕組(P＜0.05)，極顯著高于豆粕組(P＜0.01)。采食后9 h，棉籽粕組顯著高于其余3組(P＜0.05)。從各組平均值來看，各組間差異不顯著(P＞0.05)，從數(shù)值上排序?yàn)槊拮哑山M＞基礎(chǔ)組＞豆粕組＞菜籽粕組。

2.2.4 黃色瘤胃球菌

基礎(chǔ)組和菜籽粕組的黃色瘤胃球菌數(shù)量在采食后9 h時達(dá)到最大值，豆粕組和棉籽粕組在采食后7 h時達(dá)到最大值。除采食后3 h時菜籽粕組和豆粕組差異不顯著(P＞0.05)外，3個試驗(yàn)組其余4個時間點(diǎn)和平均值都是菜籽粕組顯著或極顯著高于豆粕組和棉籽粕組(P＜0.05或 P＜0.01)。除采食后1和3 h時，豆粕組顯著高于棉籽粕組(P＜0.05)外，其余3個時間點(diǎn)和平均值豆粕組和棉籽粕組差異不顯著(P＞0.05)。

2.2.5 產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌

基礎(chǔ)組、菜籽粕組、豆粕組和棉籽粕組的產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌的數(shù)量分別在采食后3、9、7和7 h達(dá)到最大值。采食后1 h，菜籽粕組和豆粕組產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌的數(shù)量顯著高于棉籽粕組和基礎(chǔ)組(P＜0.05)。采食后3和7 h，3個試驗(yàn)組間差異均不顯著(P＞0.05)。采食后5 h，菜籽粕組顯著高于豆粕組(P＜0.05)。采食后9 h，菜籽粕組顯著高于豆粕組和棉籽粕組(P＜0.05)。從各組平均值來看，菜籽粕組產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌數(shù)量顯著高于豆 粕組和棉籽粕組(P＜0.05)。

表4 不同蛋白質(zhì)飼料對瘤胃固相黏附纖維降解微生物數(shù)量的影響Table 4 Effects of different protein feeds on the populations of cellulosis microbes adherent to solid fractions in rumen%

3 討論

3.1 不同蛋白質(zhì)飼料對瘤胃固相黏附真菌數(shù)量的影響

瘤胃真菌在纖維物質(zhì)降解過程中起著積極的作用［24］。在正常飼養(yǎng)條件下，瘤胃微生物數(shù)量在109～1010個/mL時，真菌游動孢子數(shù)量在103～105個/mL之間［25－26］，本試驗(yàn)得到的真菌數(shù)量較總菌數(shù)量低4個數(shù)量級左右，與之一致。

本試驗(yàn)結(jié)果表明，不同蛋白質(zhì)飼料顯著影響瘤胃固相黏附真菌的數(shù)量，其中棉籽粕組真菌的數(shù)量平均值顯著高于菜籽粕組和豆粕組。王海榮［27］對綿羊的研究得出，不同氮源飼糧對瘤胃真菌濃度和數(shù)量影響顯著，棉籽粕組瘤胃真菌數(shù)量顯著高于豆粕組;王貞貞［28］在綿羊上的研究得到，棉籽粕組瘤胃真菌數(shù)量最多，豆粕組數(shù)量最少。以上研究均與本試驗(yàn)結(jié)果一致或相似。瘤胃厭氧真菌的種群密度與飼糧中的纖維物質(zhì)含量有很大關(guān)系，纖維物質(zhì)含量豐富的飼糧因在瘤胃中有較長的滯留時間，通常導(dǎo)致瘤胃中厭氧真菌的數(shù)量較高［29－30］，本試驗(yàn)所用的 4 種飼糧，棉籽粕組和基礎(chǔ)組的纖維含量略高于豆粕組和菜籽粕組，這與各組真菌數(shù)量的差異結(jié)果一致。

3.2 不同蛋白質(zhì)飼料對瘤胃固相黏附原蟲數(shù)量的影響

一般將原蟲分為鞭毛蟲和纖毛蟲，瘤胃中個體最大，數(shù)量最多，最重要的原蟲是纖毛蟲［31］。大多數(shù)纖毛蟲具有很強(qiáng)的纖維降解活性，去原蟲會降低纖維素的消化率［32］。已有研究表明，原蟲對不同的蛋白質(zhì)底物的作用不同，飼糧結(jié)構(gòu)在很大程度上影響反芻動物瘤胃中纖毛蟲的組成和數(shù)量［33］。王夢芝等［34］運(yùn)用遺傳指紋圖譜研究不同的蛋白質(zhì)飼料對體外培養(yǎng)瘤胃微生物發(fā)酵和其群體結(jié)構(gòu)的影響，表明原蟲區(qū)系類群結(jié)構(gòu)在各組間明顯不同;羅成［35］的研究也得出，不同蛋白質(zhì)組成的飼糧對陜北白絨山羊瘤胃原蟲蛋白質(zhì)濃度有顯著的影響。本試驗(yàn)結(jié)果說明，不同蛋白質(zhì)飼料顯著影響瘤胃固相黏附原蟲的數(shù)量，前文提及的研究結(jié)果與本試驗(yàn)的結(jié)果一致。菜籽粕組原蟲數(shù)量平均值顯著高于豆粕組和棉籽粕組，可能是因?yàn)槔w毛蟲降解可溶性蛋白質(zhì)，分解不溶性的蛋白質(zhì)顆粒能力較強(qiáng)，本課題組之前的研究就表明，菜籽粕的不可利用蛋白質(zhì)的含量極顯著地高于豆粕和棉籽粕［36］。

正常飼喂條件下，真菌和原蟲在瘤胃共存，它們在纖維物質(zhì)降解中起重要作用，但他們之間存在著捕食與被捕食的關(guān)系，原蟲攝取了真菌的假根和孢子囊［37］，原蟲對營養(yǎng)物質(zhì)的利用導(dǎo)致真菌數(shù)量減少［38］，而且原蟲的酶可以降解真菌細(xì)胞壁，這種方式對真菌的生長有負(fù)面影響。本試驗(yàn)棉籽粕組和菜籽粕組在原蟲和真菌的數(shù)量上剛好相反，或許正是這個原因造成的。

3.3 不同蛋白質(zhì)飼料對瘤胃固相黏附纖維素分解菌數(shù)量的影響

反芻動物是粗飼料的主要利用者，細(xì)胞壁降解的80%由瘤胃中細(xì)菌和真菌完成。細(xì)菌由于其在數(shù)量上的絕對優(yōu)勢，在纖維物質(zhì)分解過程中發(fā)揮了特別重要的作用。瘤胃中的纖維素分解菌主要包括白色瘤胃球菌、黃色瘤胃球菌和產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌［3］。

本試驗(yàn)結(jié)果表明，3種纖維素分解菌中，各組產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌的數(shù)量最高，這與前人的研究結(jié)果一致［21，27，39］，說明產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌也是宣漢黃牛瘤胃內(nèi)的優(yōu)勢纖維素分解菌。棉籽粕組白色瘤胃球菌和產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌的數(shù)量均高于豆粕組，這與王海榮［27］在綿羊上研究得到的結(jié)果一致。豆粕組和菜籽粕組白色瘤胃球菌的數(shù)量均高于黃色瘤胃球菌的數(shù)量，可能是因?yàn)榘咨鑫盖蚓a(chǎn)生的細(xì)菌素抑制了黃色瘤胃球菌的生長［40］。菜籽粕組白色瘤胃球菌的數(shù)量在各試驗(yàn)組間最低，棉籽粕組最高，但是菜籽粕組產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌的數(shù)量最高，顯著高于豆粕組和棉籽粕組，這可能是因?yàn)楫?dāng)產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌與瘤胃球菌同時存在時，產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌的數(shù)量明顯受到抑制［24］。當(dāng)以纖維素為碳源時，黃色瘤胃球菌與產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌存在著競爭關(guān)系，底物不同會影響到它們的競爭狀態(tài)［41］。本試驗(yàn)豆粕組黃色瘤胃球菌的數(shù)量顯著低于棉籽粕組，但是其產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌的數(shù)量高于棉籽粕組，可能正是因?yàn)榈孜锏牟煌瑢?dǎo)致競爭狀態(tài)的差異。

4 結(jié)論

不同蛋白質(zhì)飼料對瘤胃固相黏附纖維降解微生物的數(shù)量有顯著影響，以菜籽粕對宣漢黃牛瘤胃固相黏附纖維降解微生物的促進(jìn)效應(yīng)最好。

［1］ 袁濤，張偉力.我國幾種蛋白質(zhì)飼料資源現(xiàn)狀［J］.江西飼料，2004(2):25－28.

［2］ SUN Y Z，MAO S Y，YAO W，et al.DGGE and 16S rDNA analysis reveals a highly diverse and rapidly colonising bacterial community on different substrates in the rumen of goats［J］.Animal，2008，2(3):391－398.

［3］ STEWART C S，F(xiàn)LINT H J，BRYANT M P.The rumen bacteria［M］//HOBSON P N，STEWART C S.The rumen microbial ecosystem.Netherlands:Springer，1997:10－72.

［4］ FERNANDO S C，PURVIS Ⅱ H T，NAJAR F Z，et al.Rumen microbial population dynamics during adaptation to a high-grain diet［J］.Applied and Environmental Microbiology，2010，76(22):7482－7490.

［5］ KIM M，MORRISON M，YU Z T，et al.Phylogenetic diversity of bacterial communities in bovine rumen as affected by diets and microenvironments［J］.Folia Microbiology，2011，56(5):453－458.

［6］ PETRI R M，F(xiàn)ORSTER R J，YANG W，et al.Characterization of rumen bacterial diversity and fermentation parameters in concentrate fed cattle with and without forage［J］.Journal of Applied Microbiology，2012，112(6):1152－1162.

［7］ CARBERRY C A，KENNY D A，HAN S，et al.Effect of phenotypic residual feed intake and dietary forage content on the rumen microbial community of beef cattle［J］.Applied and Environmental Microbiology，2012，78(14):4949－4958.

［8］ 馮薇，王加啟，劉開朗，等.運(yùn)用PCR-DGGE分析比較瘤胃中不同飼料固相粘附微生物區(qū)系［J］.畜牧獸醫(yī)學(xué)報，2010，41(12):1556－1562.

［9］ HUWS S A，LEE M R，MUETZEL S M，et al.Forage type and fish oil cause shifts in rumen bacterial diversity［J］.FEMS Microbiology Ecology，2010，73(2):396－407.

［10］ KONG Y H，TEATHER R，F(xiàn)ORSTER R.Composition，spatial distribution，and diversity of the bacterial communities in the rumen of cows fed different forages［J］.FEMS Microbiology Ecology，2010，74(3):612－622.

［11］ MCALLISTER T A，BAE H D，JONES G A，et al.Microbial attachment and feed digestion in the rumen［J］.Journal of Animal Science，1994，72(11):3004－3018.

［12］ KIM M，MORRISON M，YU Z.Status of the phylogenetic diversity census of ruminal microbiomes［J］.FEMS Microbiology Ecology，2011，76(1):49－63.

［13］ 張麗英.飼料分析及飼料質(zhì)量檢測技術(shù)［M］.3版.北京:中國農(nóng)業(yè)大學(xué)出版社，2007.

［14］ VAN SOEST P J，ROBERTSON J B，LEWIS B A.Methods for dietary fiber，neutral detergent fiber，and nonstarch polysaccharides in relation to animal nutrition［J］.Journal of Dairy Science，1991，74(10):3583－3597.

［15］ HARRIS W D，POPAT P.Determination of the phosphorus content of lipids［J］.Journal of the American Oil Chemists’Society，1954，31(4):124－127.

［16］ KANG SH，DENMAN SE，MORRISON M I.An efficient RNA extraction method for estimating gut microbial diversity by polymerase chain reaction［J］.Current Microbiology，2009，58(5):464－471.

［17］ LARUE R，YU Z T，PARISI V A.Novel microbial diversity adherent to plant biomass in the herbivore gastrointestinal tract，as revealed by ribosomal intergenic spacer analysis and rrs gene sequencing［J］.Environmental Microbiology，2005，7(4):530－543.

［18］ MUYZER G，DE WAAL E C，UITTERLINDEN A G.Profiling of complex microbial populations by denaturing gradient gel electrophoresis analysis of polymerase chain reaction-amplified genes coding for 16S rRNA［J］.Applied and Environmental Microbiology，1993，59(3):695－700.

［19］ 徐愛秋，王夢芝，王洪榮，等.體外培養(yǎng)條件下氨基酸對瘤胃蛋白質(zhì)降解菌生長限制性的影響［J］.動物營養(yǎng)學(xué)報，2010，22(1):88－92.

［20］ DENMAN S E，TOMKINS N W，MCSWEENEY C S.Quantitation and diversity analysis of ruminal methanogenic populations in response to the antimethanogenic compound bromochloromethane［J］.FEMS Microbiology Ecology，2007，62(3):313－322.

［21］ KOIKE S，KOBAYASHI Y.Development and use of competitive PCR assays for the rumen cellulolytic bacteria:Fibrobacter succinogenes，Ruminococcus albus and Ruminococcus flavefaciens［J］.FEMS Microbiology Letters，2001，204(2):361－366.

［22］ DENMAN S E，MCSWEENEY C S.Development of a real-time PCR assay for monitoring anaerobic fungal and cellulolytic bacterial populations within the rumen［J］.FEMSMicrobiology Ecology，2006，58(3):572－582.

［23］ CHEN X L，WANG J K，WU Y M，et al.Effects of chemical treatments of rice straw on rumen fermentation characteristics，fibrolytic enzyme activities and populations of liquid-and solid-associated ruminal microbes in vitro［J］.Animal Feed Science and Technology，2008，141(1/2):1－14.

［24］ 馮仰廉.反芻動物營養(yǎng)學(xué)［M］.北京:科學(xué)出版社，2004.

［25］ HUNGATE R E.A roll-tube method for cultivation of strict anaerobes［M］//Methods in microbiology.London:Academic Press，1969:117－132.

［26］ THEODOROU M K，GILL M，KING-SPOONER C，et al.Enumeration of anaerobic chytridiomycetes as thallus-forming units:novel method for quantification of fibrolytic fungal populations from the digestive tract ecosystem［J］.Applied and Environmental Microbiology，1990，56(4):1073－1078.

［27］ 王海榮.不同日糧精粗比及氮源對綿羊瘤胃纖維降解菌群和纖維物質(zhì)降解的影響［D］.博士學(xué)位論文.呼和浩特:內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)，2006.

［28］ 王貞貞.不同氮源日糧對綿羊瘤胃纖維降解菌群及纖維降解的影響［D］.碩士學(xué)位論文.呼和浩特:內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)，2007.

［29］ DEHORITY B A，ORPIN C G.Development of，and natural fluctuations in，rumen microbial populations［M］//HOBSON P N，STEWART C S.The rumen microbial ecosystem.Netherlands:Springer，1997:196－245.

［30］ FONDEVILA M，DEHORITY B A.Interactions between Fibrobacter succinogenes，Prevotella ruminicola，and Ruminococcus flavefaciens in the digestion of cellulose from forages［J］.Journal of Animal Science，1996，74(3):678－684.

［31］ USHIDA K，JOUANY J P.Methane production associated with rumen-ciliated protozoa and its effect on protozoan activity［J］.Letters in Applied Microbiology，1996，23(2):129－132.

［32］ YANG C JM，VARGAT G A.The effects of continuous ruminal dosing with dioctyl sodium sulphosuccinate on ruminal and metabolic characteristics of lactating Holstein cows［J］.British Journal of Nutrition，1993，69(2):397－408.

［33］ IVAN M，NEILL L，F(xiàn)ORSTER R，et al.Effects of Isotricha，Dasytricha，Entodinium，and total fauna on ruminal fermentation and duodenal flow in wethers fed different diets［J］.Journal of Dairy Science，2000，83(4):776－787.

［34］ 王夢芝，喻禮懷，王洪榮，等.不同蛋白質(zhì)飼料對瘤胃微生物體外發(fā)酵和群體結(jié)構(gòu)的影響［J］.動物營養(yǎng)學(xué)報，2009，21(5):673－679.

［35］ 羅成.不同蛋白質(zhì)飼料對陜北白絨山羊瘤胃內(nèi)環(huán)境及MCP濃度和瘤胃微生物群落的影響［D］.碩士學(xué)位論文.楊凌:西北農(nóng)林科技大學(xué)，2011.

［36］ 唐春梅.不同來源蛋白飼料的養(yǎng)分組成差異及瘤胃降解效率的比較研究［D］.碩士學(xué)位論文.雅安:四川農(nóng)業(yè)大學(xué)，2013.

［37］ WILLIAMS A G，WITHERS S E，ORPIN C G.Effect of the carbohydrate growth substrate on polysaccharolytic enzyme formation by anaerobic fungi isolated from the foregut and hindgut of nonruminant herbivores and the forestomach of ruminants［J］.Letters in Applied Microbiology，1994，18(3):147－151.

［38］ MORGAVI D P，SAKURADA M，TOMITA Y，et al.Presence in rumen bacterial and protozoal populations of enzymes capable of degrading fungal cell walls［J］.Microbiology，1994，140(3):631－636.

［39］ KOIKE S，PAN J，KOBAYASHI Y，et al.Kinetics of in sacco fiber-attachment of representative ruminal cellulolytic bacteria monitored by competitive PCR［J］.Journal of Dairy Science，2003，86(4):1429－1435.

［40］ ODENYO A A，MACKIE R I，STAHL D A，et al.The use of 16S rRNA-targeted oligonucleotide probes to study competition between ruminal fibrolytic bacteria:development of probes for ruminococcus species and evidence for bacteriocin production［J］.Applied and Environmental Microbiology，1994，60(10):3688－3669.

［41］ ODENYO A A，MACKIE R I，STAHL D A，et al.The use of 16S rRNA-targeted oligonucleotide probes to study competition between ruminal fibrolytic bacteria:pure-culture studies with cellulose and alkaline peroxide-treated wheat straw［J］.Applied and Environmental Microbiology，1994，60(10):3697－3703.