李 龍 蔣守群 鄭春田 茍鐘勇 陳 芳阮 棟 林廈菁

(廣東省農(nóng)業(yè)科學院動物科學研究所，畜禽育種國家重點實驗室，農(nóng)業(yè)部華南動物營養(yǎng)與飼料重點實驗室廣東省動物育種與營養(yǎng)公共實驗室，廣東省畜禽育種與營養(yǎng)研究重點實驗室，廣州 510640)

銅是動物體內必需的微量元素，在許多生化過程中都扮演著重要的角色，銅以酶輔助因子的形式參與體內30多種酶的合成和活化，并且通過酶的活性中心對動物的生長消化、繁殖機能、免疫功能、抗氧化性能以及造血機能產(chǎn)生影響［1-3］，因此研究黃羽肉雞銅需要量對于提高黃羽肉雞的生長性能、免疫和抗氧化性能等有重要意義。對肉雞銅需要量的研究以白羽肉雞為主［4-8］，周桂蓮等［5］在對7～8周齡肉公雞銅需要量的研究中發(fā)現(xiàn)，以生長性能和體銅沉積率為評判指標時，其需要量為10 mg/kg，但是對不同階段黃羽肉雞的銅需要量缺乏系統(tǒng)的研究。黃羽肉雞是我國著名的地方肉雞品種，因其肉質鮮美、風味獨特，在我國肉雞市場中的占有率愈來愈高。2004年，我國農(nóng)業(yè)部參考我國雞的飼養(yǎng)標準(1988)和NRC雞的營養(yǎng)需要(1994)標準制定了《雞飼養(yǎng)標準》(NY/T 33—2004)。在生產(chǎn)上，有關黃羽肉雞營養(yǎng)方面的需求參數(shù)仍然是沿用白羽肉雞的飼養(yǎng)標準，該推薦量已經(jīng)不能滿足生產(chǎn)實際上的需要，所以研究適應銅水平對黃羽肉雞健康生長發(fā)育和充分發(fā)揮生長潛力尤為重要。本文旨在通過飼養(yǎng)試驗，研究飼糧添加不同水平銅對43～63日齡階段快大型嶺南黃羽肉公雞生長性能、抗氧化性能及血清和肝臟銅含量的影響，從而確定這個生長階段黃羽肉公雞銅需要量，為微量元素添加劑的安全有效應用、黃羽肉雞飼糧的科學配制和黃羽肉雞飼養(yǎng)標準的修訂提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗設計

試驗采用單因子完全隨機設計。選用43日齡快大型嶺南黃羽肉公雞900只，根據(jù)體重均衡原則隨機分成 6個組，分別飼喂添加 0、4、8、16、32、64 mg/kg銅的飼糧。每個組6個重復，每個重復25只雞。

1.2 試驗飼糧

試驗采用純合基礎飼糧，其營養(yǎng)水平參考NY/T 33—2004標準中的黃羽肉雞營養(yǎng)需要，根據(jù)《中國飼糧成分表》(第15版)，計算飼糧配方，參考Okonkwp等［9］的方法選用大豆?jié)饪s蛋白、酪蛋白、葡萄糖、玉米淀粉等配制純合基礎飼糧。組1為對照組，飼喂基礎飼糧，銅水平為2.74 mg/kg，組2～6為試驗組，在基礎飼糧中添加不同水平硫酸銅，使銅水平分別為 6.74、10.74、18.74、34.74、66.74 mg/kg。各組飼糧除銅水平不同，其他營養(yǎng)成分水平基本一致?；A飼糧組成及營養(yǎng)水平見表1。

表1 基礎飼糧組成與營養(yǎng)水平(風干基礎)Table 1 Composition and nutrient levels of basal diets(air-dry basis) %

1.3 試驗動物飼養(yǎng)管理

本試驗在廣東省農(nóng)業(yè)科學院動物科學研究所動物營養(yǎng)室試驗場進行。由廣東省農(nóng)業(yè)科學院動物科學研究所智威農(nóng)業(yè)科技股份有限公司購入1日齡健康、發(fā)育良好的嶺南快長型黃羽肉雞公雛，根據(jù)我國黃雞飼養(yǎng)標準配制飼糧飼養(yǎng)，1～42日齡所有雞統(tǒng)一飼喂，1～21日齡飼糧銅水平為2.80 mg/kg，22～42 日齡飼糧銅水平為2.75 mg/kg(表1)。43日齡時，根據(jù)體重均衡原則試雞隨機分組飼養(yǎng)，43～63日齡飼喂不同銅水平飼糧，具體分組方法按照試驗設計進行。試雞采用網(wǎng)上平養(yǎng)，自由采食與飲水。其他按常規(guī)飼養(yǎng)操作規(guī)程進行。

1.4 測定指標與方法

試驗全期，每天仔細觀察雞群的精神狀態(tài)、食欲、糞便、缺乏癥、死亡等情況，記錄試驗各組雛雞的死亡數(shù)，并對病死雞逐只進行病理剖檢，查明死因。

試驗結束時，根據(jù)平均體重選取試雞2只翅靜脈采血約10 mL，在室溫下傾斜放置30 min后，3 500 r/min離心10 min，分離血清于-20℃保存待測。剖摘肝臟、雙側胸肌，做好標記，-20℃保存待測。

1.4.1 生產(chǎn)性能

飼養(yǎng)期間以重復為單位，記錄每天的采食量。在試驗結束前1天22:00斷料供水，于次日清晨以重復為單位稱雞空腹重、結料，計算平均日增重、平均日采食量和料重比，記錄死亡數(shù)，計算死亡率。

1.4.2 血清和肝臟銅含量

血清銅含量采用火焰原子吸收光譜儀(SpectrAA-50/55型，美國瓦里安公司)測定，操作步驟為:取200μL血漿于100 mL燒杯中，加5 mL濃硝酸(優(yōu)級純)，蓋上表面皿，置于電熱板上消煮至澄清透明，待消煮過的樣品冷卻后用去離子水定容至10 mL，搖勻后測定銅含量;肝臟銅含量測定同血清銅含量測定方法。

1.4.3 抗氧化指標

血清、肝臟、胸肌中的銅鋅超氧化物歧化酶(CuZn-superoxide dismutase，CuZn-SOD)活性采用紫外可見分光光度計(Biomate-5型，美國熱電公司)測定;血清、肝臟、胸肌中的過氧化產(chǎn)物丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量采用硫代巴比妥酸(TBA)比色法在紫外可見光分光光度儀上測定;血清中銅藍蛋白(ceruloplasmin，CP)活性用酶標儀(SprctrsaMax-5型，美國瓦里安公司)按照聯(lián)大茴香胺法測定;肝臟中金屬硫蛋白(metallothionein，MT)含量用酶標儀按照鎘血紅蛋白親和力分析法測定［10］。以上所用的分析試劑盒均購自南京建成生物工程研究所，樣品處理方法按照試劑盒內說明書步驟操作。

1.5 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計

試驗數(shù)據(jù)采用SAS 8.2軟件的GLM程序進行方差分析并進行多項式線性和二次曲線分析。統(tǒng)計顯著性水平為 P＜0.05，極顯著性水平為 P＜0.01。各組試驗數(shù)據(jù)均以平均值±標準誤(mean±SE)表示。對相關敏感指標平均日采食量和肝臟CuZn-SOD活性分別擬合折線和二次曲線等不同的數(shù)學模型，然后根據(jù)擬合度選擇擬合最佳的模型，用以確定黃羽肉公雞銅需要量。其中，對平均日采食量和肝臟CuZn-SOD活性指標采用Baker等［11］和 Robbins等［12］的方法，運用 SAS 軟件的REG程序和NLIN程序建立二次曲線方程(Y=AX2+BX+C，X＜X0;Y=AX20+BX0+C，X≥X0。式中:Y代表平均日采食量或肝臟CuZn-SOD活性，X代表飼糧銅水平，A和B分別代表方程二次項和一次項的系數(shù)，C代表方程的常數(shù)項，X0代表拐點所對應的飼糧銅水平，即為黃羽肉公雞銅需要量)與單斜率折線性方程(Y=AX+B，X＜X0;Y=AX0+B，X≥X0。式中:Y代表平均日采食量或肝臟CuZn-SOD活性，X代表飼糧銅水平，A代表斜率，B代表截距，X0代表拐點所對應的飼糧銅水平，即為黃羽肉公雞銅需要量)。

2 結果與分析

2.1 飼糧銅添加水平對43～63日齡黃羽肉公雞生長性能的影響

由表2可知，飼糧添加不同水平銅對料重比沒有顯著影響(P＞0.05);16、32、64 mg/kg 銅組試雞末重顯著高于對照組和4 mg/kg銅組(P＜0.05)，而與 8 mg/kg 銅組差異不顯著(P＞0.05);16、32 mg/kg銅組試雞平均日增重顯著高于對照組和4 mg/kg銅組(P＜0.05)，而與其他組差異不顯著(P＞0.05);16、32 mg/kg銅組試雞平均日采食量顯著高于對照組(P＜0.05)，而與 4、64 mg/kg銅組比較則差異不顯著(P＞0.05)。

表2 飼糧銅添加水平對43～63日齡黃羽肉公雞生長性能的影響Table 2 Effects of dietary copper level on growth performance of male yellow-feathered broilers aged from 43 to 63 days of age

2.2 飼糧銅添加水平對63日齡黃羽肉公雞血清、肝臟銅含量的影響

由表3可知，飼糧添加不同水平銅對血清中銅的含量影響不顯著(P＞0.05);8、16mg/kg銅組試雞肝臟中銅含量顯著低于對照組、4 mg/kg銅組(P＜0.05)，16 mg/kg 銅 組 還 顯 著 低 于 32、64 mg/kg銅組(P＜0.05)。

表3 飼糧銅添加水平對63日齡黃羽肉公雞血清和肝臟銅含量的影響Table 3 Effects of dietary copper level on copper content in serum and liver of male yellow-feathered broilers at 63 days of age

2.3 飼糧銅添加水平對63日齡黃羽肉雞血清、肝臟、胸肌抗氧化指標的影響

由表4可知，飼糧銅添加水平對血清中MDA含量的影響不顯著(P＞0.05);16、32 mg/kg銅組試雞血清CuZn-SOD活性顯著高于對照組、4和8 mg/kg銅組(P＜0.05)，而與 64 mg/kg 銅組比較則差異不顯著(P＞0.05);16、32、64 mg/kg 銅組試雞血清銅藍蛋白活性顯著低于對照組、4和8 mg/kg銅組(P＜0.05)。飼糧添加不同水平銅對肝臟中MDA和MT的含量影響不顯著(P＞0.05);32、64 mg/kg 銅組試雞肝臟中 CuZn-SOD活性顯著高于其他組(P＜0.05)，而其他組之間差異不顯著(P＞0.05)。飼糧添加不同水平銅對試雞胸肌 CuZn-SOD活性無顯著影響(P＞0.05);32、64 mg/kg銅組的胸肌MDA含量顯著低于其他組(P＜0.05)，而與其他組之間則差異不顯著(P＞0.05)。

表4 飼糧銅添加水平對63日齡黃羽肉雞血清、肝臟、胸肌抗氧化指標的影響Table 4 Effects of dietary copper level on antioxidant indices in serum，liver and chest muscle of male yellow-feathered broilers at 63 days of age

2.4 43～63日齡黃羽肉公雞飼糧銅需要量的估測

如表5所示，若作二次折線方程預測，當以平均日增重為效應指標時，該階段達到最佳平均日增重時的銅需要量為 30.98 mg/kg;當以CuZn-SOD活性為效應指標時的銅需要量為57.72 mg/kg。若作單斜率折線方程預測，當以平均日增重為效應指標時，該階段達到最佳平均日增重時的銅需要量為19.94 mg/kg;當以 CuZn-SOD活性為效應指標時的銅需要量為38.34 mg/kg。

表5 折線回歸模型估測銅需要量Table 5 Copper requirement estimated by broken-line regression

3 討 論

3.1 飼糧銅添加水平對43～63日齡黃羽肉公雞生長性能的影響

關于不同飼糧銅水平對肉雞生長性能的影響，不同研究者得出的結論不一致。周桂蓮等［5］、申愛華等［6］研究認為，肉仔雞后期飼糧銅添加量為10 mg/kg左右其生長性能最佳。常新耀等［13］、張春善等［14］進行的肉仔雞微量元素添加劑配方生產(chǎn)效果的驗證試驗報道，配制飼喂玉米-豆粕型飼糧時，在飼糧時添加銅8 mg/kg(CuSO4·5H2O)，可滿足最佳生長性能需要。本試驗結果表明，飼糧添加銅能顯著改善43～63日齡黃羽肉雞的生長性能，當飼糧添加銅水平為16 mg/kg(總銅為18.74 mg/kg)時，肉雞的末重、平均日增重、平均日采食量最大。造成以上研究結果不一致的原因可能與試驗的飼糧類型及肉雞品種、日齡、飼糧等不同有關。本試驗所用飼糧是純合飼糧，基礎飼糧中銅含量比玉米-豆粕型飼糧低，故添加水平可能就相對較高才能滿足需要，再加上快大型黃羽肉雞與白羽肉雞不同生理結構和特性，其銅添加水平對生長性能影響也不同。

3.2 飼糧銅添加水平對43～63日齡黃羽肉公雞血清、肝臟銅含量的影響

研究表明，隨著飼糧中銅水平的升高，血清中銅的含量增高［15-16］。但是本試驗結果表明，隨著飼糧中銅水平的升高，血清中銅的含量差異不顯著。也有研究表明，血清銅含量在膳食銅水平達到某一臨界值時才會發(fā)生可檢測的變化［17］，攝食銅缺乏或不同銅水平飼糧的動物血漿銅含量沒有顯著差異，這可能是由于血液中銅含量受動物體內存在強大的體內平衡機制調控，從而維持內環(huán)境血漿銅含量相對恒定［18-19］;并且動物對一定范圍內飼糧中的高銅具有通過增加膽汁中的銅排泄來保持銅平衡的能力［20］，而本試驗設計的銅的梯度范圍可能恰好在黃羽肉雞血清銅體內平衡機制調控之內，所以血清銅含量差異不顯著，但是具體機理還需要進一步研究。

肝臟是體內銅的重要貯存和代謝器官，肝臟銅含量能反映體內銅的狀態(tài)［2，20-21］。有研究表明隨飼糧銅水平提高，肝臟銅含量增加［2，22-23］，但是本試驗結果表明隨著飼糧銅水平的提高，肝臟銅含量并不顯著增加。也有研究表明臨界缺乏的低銅狀態(tài)下機體能通過加強肝臟銅的蓄積以平衡或滿足銅的需要［24］，一定劑量和時間范圍內的飼糧高銅能有效地促進肝臟銅的蓄積，但當肝臟銅的蓄積量達到飽和時，繼續(xù)增加飼糧銅含量則導致肝臟銅迅速大量地釋放，肝臟銅含量降低，并維持在相對穩(wěn)定的低水平狀態(tài)［25-26］。本試驗結果表明，飼糧銅水平在 2.74和 6.74 mg/kg時，肝臟銅含量差異不顯著;但飼糧銅水平在 10.74和18.74 mg/kg時，肝臟銅含量顯著降低;飼糧銅水平在34.74和66.74 mg/kg時，肝臟銅含量也有降低的趨勢，因此說明黃羽肉雞在肝臟銅的蓄積量達到飽和時，肝臟銅含量降低，但是其中具體的機理還需要進一步研究與驗證。

3.3 飼糧銅添加水平對43～63日齡黃羽肉公雞抗氧化性能的影響

銅的生理功能之一是抗氧化作用，銅能參與到抗氧化防御系統(tǒng)中，影響自由基和改變抗氧化酶與底物的狀態(tài)，銅嚴重缺乏或過量都會引起病變，包括許多血漿和組織中含銅酶等生化指標的顯著變化［27］。

CuZn-SOD是最常見的抗氧化酶之一，也是機體內超氧自由基的主要清除劑，對于維持生物膜的完整性，機體免疫功能，動物健康都有非常重要的作用。在調節(jié)CuZn-SOD功能活性的表達中銅較鋅起著更主要的作用，銅作為CuZn-SOD的輔助因子，Dameron等［28］報道幼年生長動物主動脈中的CuZn-SOD活性受到飼糧中銅水平的調節(jié)，當動物飼糧缺銅時，可降低其許多組織中CuZn-SOD的活性［29］，并且CuZn-SOD活性隨飼糧銅水平的升高顯著提高［30］。本研究飼糧添加不同水平銅顯著提高了血清和肝臟里CuZn-SOD的活性，這與上述結果一致，但是胸肌里的CuZn-SOD的活性無差異，這表明在本試驗條件下，不同銅水平對胸肌該氧化酶的活性沒有調節(jié)作用。

銅藍蛋白可作為超氧陰離子的清除劑，能抑制通過黃嘌呤氧化酶調節(jié)的正鐵細胞色素C的還原作用，以減少此過程中誘發(fā)的超氧陰離子自由基的生成，具有類似CuZn-SOD的作用［31］，銅藍蛋白主要由肝臟合成，然后隨血液循環(huán)在身體各處發(fā)揮作用［32］。許多研究證實，飼糧中添加銅可提高銅藍蛋白的活性［33-34］。但也有研究表明銅藍蛋白活性隨飼糧銅水平的增加而升高，但當飼糧銅水平達到一定劑量(過量劑量)時，銅藍蛋白活性顯著下降［35-37］，并且因為肝細胞內質網(wǎng)中合成的脫銅銅藍蛋白與吸收肝臟中的銅離子結合形成血漿銅藍蛋白，隨后被分泌入血漿［20］，所以血漿中銅藍蛋白和肝臟銅含量有一定聯(lián)系。本試驗結果表明，與對照組相比，隨著飼糧中銅水平升高未出現(xiàn)肝臟銅藍蛋白的活性顯著升高的情況，反而是達到銅水平達到18.74 mg/kg后銅藍蛋白活性顯著下降，說明可能已經(jīng)到達過量劑量，并且銅水平達到18.74 mg/kg后，肝臟銅含量下降或者有下降的趨勢，說明銅藍蛋白和肝臟銅含量在一定程度具有關聯(lián)性，這也與何霆等［38］的研究結果一致，但是具體的機理還需要進一步研究與驗證。

MT在體內主要與銅和鋅結合，組織中MT濃度受鋅和銅狀態(tài)的影響，當鋅水平穩(wěn)定時，銅的攝取速度超過了細胞內銅的清除能力而發(fā)生銅沉積時，將誘導大量MT合成，而銅缺乏時，肝臟MT的代謝也會發(fā)生改變［39］。本試驗研究表明，飼糧不同水平銅對試雞肝臟中MT的含量無影響，這可能是由于動物機體內銅攝取速度和細胞內銅的清除能力能保持一種動態(tài)平衡［40］，從而使肝臟中的MT含量沒有顯著變化，但是具體的機理還需要進一步研究與驗證。

MDA是脂質過氧化降解的主要產(chǎn)物，其含量反映了體內脂質過氧化的氧化程度及細胞受自由基攻擊的程度。測定MDA的含量可反映機體內脂質過氧化強弱，間接反映機體氧化損傷的程度［41-42］。本試驗結果表明，飼糧中不同水平的銅對血清和肝臟中MDA含量也無顯著影響，說明血清和肝臟中的脂質過氧化物的生成量在該銅水平范圍內較穩(wěn)定。但是隨著銅水平提高一定程度卻能降低胸肌里的MDA含量，說明隨著銅水平的提高，可降低胸肌里的過氧化物的生成量。

3.4 黃羽肉公雞銅需要量的探討

研究畜禽營養(yǎng)素需要量的方法多種多樣，傳統(tǒng)營養(yǎng)學上常采用劑量反應法研究畜禽營養(yǎng)素需要量，但隨著統(tǒng)計知識和SAS軟件的開發(fā)應用，越來越多的學者采用建立合適的數(shù)學模型這一方法來描述和預測畜禽對營養(yǎng)素的需要量和反應［11-12］。評定營養(yǎng)需要量時，隨著飼糧銅水平的增加，反應指標要達到一個平臺期，即不再有顯著意義上的增加或降低［43］。根據(jù)這一定義，本試驗適宜評價銅營養(yǎng)需要量的指標為平均日增重、平均日采食量、血清和肝臟中CuZn-SOD活性和胸肌中MDA含量。本試驗通過方差分析、多重比較結果和折線擬合后的結果，以平均日增重、平均日采食量、血清和肝臟中CuZn-SOD活性和胸肌中MDA含量適宜作為評價指標，43～63日齡黃羽肉公雞銅需要量分別為18.74和34.74 mg/kg;由表5可知選用的2種折線回歸模型中平均日增重和肝臟CuZn-SOD活性的回歸系數(shù)以單斜率折線方程的R2值最大，說明該階段平均日增重和肝臟CuZn-SOD活性比較符合單斜率折線方程，通過其回歸模型以平均日增重、肝臟中CuZn-SOD活性估測的43～63日齡黃羽肉公雞銅需要量分別為19.94 和 38.34 mg/kg。

國內外有關肉雞的銅需要量的大部分接近于NRC(1994)和黃羽肉雞飼養(yǎng)標準(2004)的推薦量 8 mg/kg［4-6］，F(xiàn)eedstuffs 的 推 薦 標 準 是11 mg/kg［4］。從本試驗結果來看，43～ 63 日齡黃羽肉公雞獲得最佳生長性能和抗氧化功能的銅需要量分別為18.74和 34.74 mg/kg，通過折線回歸模型以平均日增重、肝臟中CuZn-SOD活性估測的飼糧銅需要量分別為 19.94和 38.34 mg/kg，都高于 NRC雞的營養(yǎng)需要(1994)和 NY/T 33—2004標準中黃羽肉雞銅營養(yǎng)需要的推薦量(8 mg/kg);這可能與雞的品種和評價指標不同有關。研究表明黑色素和褐色素的相對數(shù)量與分布決定了動物被毛表現(xiàn)出從白至黑多種毛色［44］，其中起最重要作用的就是絡氨酸酶，銅含量的多少直接影響酪氨酸酶的活性，并且酪氨酸酶能氧化酪氨酸形成黑色素和形成褐色素的前體物質，進而影響毛色［45-46］;由于黃羽肉雞羽毛比白羽肉雞羽毛色素沉積量更高，這就有可能需要更多的酪氨酸酶，所以就表現(xiàn)出黃羽肉雞比白羽肉雞銅需要量高;其次NRC選用以生產(chǎn)性能為評價指標，而本試驗以生長性能和抗氧化性能為評價指標，這種評判指標不同也能造成需要量差異;因此，生產(chǎn)中應根據(jù)雞的品種和評判指標對肉雞銅添加量做適當調整。

由于本試驗結果中銅需要量遠高于NRC雞的營養(yǎng)需要(1994)和NY/T 33—2004標準中黃羽肉雞銅營養(yǎng)需要的推薦量，有可能造成糞便銅排放增多從而對環(huán)境造成污染，因此對糞便銅含量進行的檢測和對有機銅替代無機銅減少銅排放是下一步研究的重點。

4 結 論

在本試驗條件下，以生長性能和抗氧化性能為評定指標，43～63日齡快大型黃羽肉公雞銅需要量分別為 18.74、34.74 mg/kg;而通過折線回歸模型以平均日增重、肝臟中CuZn-SOD活性估測的銅需要量分別為 19.94 和 38.34 mg/kg。

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