文│朱芳賢 孟飛 許海濤 陸健 趙俊金 張俊杰 劉丑生（全國畜牧總站）

冷凍胚胎保存動(dòng)物遺傳資源與其他保存技術(shù)相比具有突出的優(yōu)越性，胚胎保存了品種的全部基因，若有數(shù)量充足的胚胎，可保存與現(xiàn)有物種遺傳多樣性一致的遺傳資源。細(xì)胞可以在超低溫條件下長期保存，即使活物消失，只要存在同種物種，通過胚胎移植和核移植技術(shù)就可恢復(fù)這些遺傳資源。因此，在保護(hù)動(dòng)物遺傳資源，尤其是挽救瀕危動(dòng)物方面，冷凍胚胎技術(shù)發(fā)揮著越來越重要的作用。

大尾羊在我國廣泛分布，具有生長快、早熟、產(chǎn)肉力高、肉質(zhì)細(xì)嫩等優(yōu)點(diǎn)。但由于引入品種的代替以及雜交改良，現(xiàn)在有些品種已面臨瀕危的局面，保種工作迫在眉睫。通過對蘭州大尾羊超數(shù)排卵效果的分析，為建立其他大尾羊合理、有效的超數(shù)排卵方案提供依據(jù)。

一、材料與方法

1.時(shí)間、地點(diǎn)和品種。2010年8月引入到北京順義飼養(yǎng)，2010年10月第一次超排，2010年12月第二次超排，2011年4月第三次超排。第一次超排時(shí)供體母羊平均年齡2.5歲、平均體重43千克。

2.超數(shù)排卵方案。在發(fā)情周期的任意一天，陰道埋置新西蘭產(chǎn)陰道栓（CIDR），放栓當(dāng)天記為“第0天”，第9～12天每日早晚分2次（間隔時(shí)間相等）等量注射新西蘭產(chǎn)ovagen促卵泡素（FSH），即第9天每次2.0毫升，第10天每次1.6毫升，第11天每次1.4毫升，第12天每次1.0毫升，每只注射總量為12毫升（10.9毫克）。第6次注射FSH的同時(shí)注射氯前列烯醇（PG）0.2毫克；在第7次注射FSH時(shí)取掉CIDR；第8次注射FSH前試情，發(fā)情者不在注射FSH，注射促排卵素3號19毫克，沒有發(fā)情的注射FSH。第13天試情，發(fā)情者也注射促排卵3號19毫克。

3.配種方法。發(fā)情后12小時(shí)進(jìn)行第一次配種，第二次配種在第一次后8～12小時(shí)。采用人工輔助本交、人工授精和子宮角輸精方法。

4.胚胎采集。發(fā)情日為0天，第7天用手術(shù)法暴露子宮和子宮—輸卵管接合部，用國產(chǎn)8號導(dǎo)尿管進(jìn)行子宮角沖胚。胚胎鑒定級別執(zhí)行《畜禽細(xì)胞與胚胎冷凍保種技術(shù)規(guī)范》和《牛羊胚胎質(zhì)量檢測技術(shù)規(guī)程》。

5.統(tǒng)計(jì)方法。采用SPSS19.0對各組數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析和多重比較，結(jié)果以（平均值±標(biāo)準(zhǔn)差）表示。

二、結(jié)果及分析

1.重復(fù)超排效果比較（表1）。

如表1所示，3次超排共118只次，只均回收卵數(shù)、A級胚胎分別為7.42、5.00枚；3次重復(fù)超排只均回收卵數(shù)分別為7.87、6.68、7.71枚，差異不顯著（P＞0.05）；3次重復(fù)超排只均A級胚胎分別為6.46、4.05、4.10枚，第1次明顯高于后兩次，差異顯著（P＜0.05），后兩次沒有差異（P＞0.05）；3次重復(fù)超排只均未受精卵數(shù)分別為0.48、1.27、2.81枚，第1次低于第3次，并且差異顯著（P＜0.05），前兩次沒有差異（P＞0.05），后兩次也沒有差異（P＞0.05）。這個(gè)結(jié)果和沖胚過程中看到的供體母羊生殖器官粘連情況相吻合，隨著重復(fù)超排次數(shù)的增加發(fā)生粘連的羊增多，粘連程度也增重，造成卵子受精率降低及胚胎發(fā)育差。結(jié)果說明重復(fù)超數(shù)排卵對可用胚胎率、卵子受精率影響較大，與張果平等、李雪松等結(jié)果一致。

第2次超排只均回收卵數(shù)、A級胚胎低于第3次，可能原因是間隔時(shí)間短，供體羊還沒有得到充分恢復(fù)。第2次和第1次間隔2個(gè)月，第3次和第1次間隔4個(gè)月。

2.不同年齡母羊的超排效果比較（表2）。

如表2所示，3～4歲只均黃體數(shù)、只均回收卵數(shù)、只均A級胚胎數(shù)分別為12.33、9.00、8.06枚，高于1.5～2.5歲的10.40、7.93、5.73枚，但差異不顯著，說明蘭州大尾羊1.5歲后就可以有好的超數(shù)排卵效果。

三、討論

1.嚴(yán)格要求手術(shù)及術(shù)后護(hù)理。通過對重復(fù)超數(shù)排卵效果分析，建議在羊的超數(shù)排卵處理和采胚過程中，對手術(shù)以及手術(shù)后護(hù)理的要求要非常嚴(yán)格，避免造成子宮、輸卵管粘連。另外，重復(fù)超數(shù)排卵的間隔時(shí)間要3個(gè)月以上，使得供體羊得到充分恢復(fù)，避免了短時(shí)間內(nèi)受到連續(xù)頻繁的刺激而影響超數(shù)排卵效果。

2.供體羊的選擇。資料表明，綿羊一般到3～4歲以后排卵率達(dá)到最高峰。7歲以后產(chǎn)羔率開始下降，所以，選擇供體羊時(shí)，經(jīng)產(chǎn)母羊?yàn)槭走x。從理論上分析，初情期或初配母羊無生殖史，生殖系統(tǒng)疾病少，不育癥比例低，但作為供體不合適。因?yàn)橛裳虬l(fā)情特征不明顯，而且生理狀況不穩(wěn)定，給移植帶來了困難。所以，選擇適合年齡的供體母羊可以提高超數(shù)排卵效果，節(jié)約成本。

表1 重復(fù)超排效果比較

表2 不同年齡母羊的超排效果比較

3.受精率低的原因。超數(shù)排卵供體羊的受精率低是制約胚胎移植技術(shù)向產(chǎn)業(yè)化發(fā)展的一個(gè)重要因素。除了手術(shù)原因，一方面的原因是不合理的激素劑量使卵細(xì)胞非正常發(fā)育，影響了排卵后的卵子運(yùn)動(dòng)和受精，另一方面原因是外源激素?cái)_亂了輸卵管及子宮的內(nèi)部環(huán)境，影響了卵子和精子的結(jié)合。另外還有與配公羊的精液質(zhì)量、品質(zhì)、輸精技術(shù)的熟練程度等，都是影響超排后所得卵子受精率的重要因素。

4.配種方法。本次試驗(yàn)中都是采用本交方法配種，雖然受精率很高，但大尾羊尾部肥大，自然交配需要人工輔助，不易操作，要求輔助人員有一定的技術(shù)和體力，公羊也要有經(jīng)驗(yàn)，此次試驗(yàn)中就有三分之一的公羊沒有經(jīng)驗(yàn)而失去交配機(jī)會。

本交、子宮頸口輸精法、腹腔鏡輸精法各有其優(yōu)缺點(diǎn)。一般情況下本交及子宮頸口輸精法供體受精率較低，但對供體損傷小，有利于供體重復(fù)利用并降低術(shù)后對供體繁殖力的影響。腹腔鏡法受精率高，但會對供體造成一種刺激及損傷，輸精后不久即進(jìn)行手術(shù)法沖卵，連續(xù)刺激對供體重復(fù)利用及術(shù)后繁殖力也有一定負(fù)面影響。因此，哪種配種方式更加經(jīng)濟(jì)、合理，還要視公羊數(shù)量及能力、配種人員經(jīng)驗(yàn)等情況而定。

5.公羊飼養(yǎng)。長期的實(shí)踐證明，在嚴(yán)格挑選供體羊的同時(shí)，根據(jù)供體羊的年齡、體重、營養(yǎng)狀況等個(gè)體差異來調(diào)整激素劑量的前提下，加強(qiáng)公羊的飼養(yǎng)管理是獲得較好的超排效果的關(guān)鍵所在。