文│李瑞娜（河南省濮陽(yáng)市畜產(chǎn)品質(zhì)量安全監(jiān)測(cè)檢驗(yàn)中心）

牛奶因含有豐富的蛋白質(zhì)、氨基酸、礦物質(zhì)等營(yíng)養(yǎng)成分，已成為人們生活中不可或缺的天然食品。高品質(zhì)、無(wú)污染的牛奶在增強(qiáng)國(guó)民身體素質(zhì)中起著重要作用。當(dāng)前乳及乳制品質(zhì)量安全仍存在一定問(wèn)題，其中最突出的是抗生素的殘留。為了掩蔽抗生素的使用，一些不法分子在原料乳中添加β-內(nèi)酰胺酶這一物質(zhì)，以降解已使用的抗生素，使之無(wú)法檢出。2009年全國(guó)打擊違法添加非食用物質(zhì)和濫用食品添加劑專項(xiàng)小組明確指出β-內(nèi)酰胺酶為乳與乳制品掩蔽抗生素的違法添加非食用物質(zhì)之一。新國(guó)標(biāo)《生鮮牛乳收購(gòu)標(biāo)準(zhǔn)》中，把“抗生素殘留”作為了必檢項(xiàng)目，并明確規(guī)定限量。本文綜述了乳制品中β-內(nèi)酰胺酶的常規(guī)檢測(cè)方法，并介紹了幾種新型檢測(cè)方法。

一、微生物法

微生物法采用對(duì)青霉素類藥物絕對(duì)敏感的標(biāo)準(zhǔn)菌株，利用舒巴坦特異性抑制β-內(nèi)酰胺酶的活性，并加入青霉素作為對(duì)照，通過(guò)比對(duì)加入β-內(nèi)酰胺酶抑制劑與未加入抑制劑的樣品所產(chǎn)生的抑制圈的大小來(lái)間接測(cè)定樣品是否含有β-內(nèi)酰胺酶類藥物。崔生輝等運(yùn)用此原理建立了該酶的檢測(cè)方法，該方法在牛奶中的檢出限為4U/毫升（U為酶的活力單位）。

該方法準(zhǔn)確靈敏、應(yīng)用廣泛，但檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)、操作復(fù)雜、檢出限低，僅適用于對(duì)舒巴坦敏感的活性β-內(nèi)酰胺酶的定性檢測(cè)，不適用于快速檢測(cè)。侯東軍等通過(guò)研究影響檢測(cè)方法的多種因素如原料乳的保藏溫度、保藏時(shí)間等對(duì)試驗(yàn)進(jìn)行了優(yōu)化，提高了該檢測(cè)方法的準(zhǔn)確性和可靠性。

二、碘量法

碘量法是根據(jù)青霉素或頭孢菌素經(jīng)β-內(nèi)酰胺酶作用而產(chǎn)生的裂解酸與碘結(jié)合，與淀粉競(jìng)爭(zhēng)游離碘，從而使藍(lán)色的碘淀粉復(fù)合物褪色的原理而進(jìn)行檢測(cè)的。此法為《中國(guó)藥典》中規(guī)定的檢測(cè)β-內(nèi)酰胺酶活性的方法。謝巖黎等采用碘量法對(duì)牛奶中的β-內(nèi)酰胺酶定性、定量分析，間接判斷牛奶中是否有β-內(nèi)酰胺酶殘留。結(jié)果表明，當(dāng)酶濃度大于30U/毫升時(shí)，可以用直接碘量法對(duì)其進(jìn)行定性分析，用間接滴定法對(duì)其進(jìn)行定量分析。

該法方便快捷、試劑易得、容易操作、再現(xiàn)性好，適于基層檢測(cè)單位和現(xiàn)場(chǎng)初篩，但該方法對(duì)反應(yīng)時(shí)間等條件要求較嚴(yán)格，影響因素多，每次試驗(yàn)均需要設(shè)置陽(yáng)性和陰性對(duì)照，存在靈敏度差，檢出限高等缺點(diǎn)。

三、酸度法

酸度法是根據(jù)青霉素經(jīng)β-內(nèi)酰胺酶作用產(chǎn)生裂解酸引起pH變化，使指示劑變色或碳酸鈉溶液釋放出二氧化碳的壓力變化及以堿滴定來(lái)設(shè)計(jì)的。馬潔等利用雙酸度計(jì)法檢測(cè)了牛奶中β-內(nèi)酰胺酶的殘留量。該方法在磷酸緩沖溶液（PBS）和牛奶中，對(duì)β-內(nèi)酰胺酶的檢出限分別為10U/毫升和15U/毫升。

該法具有設(shè)備簡(jiǎn)單、操作方便、檢測(cè)時(shí)間短等優(yōu)點(diǎn)，適用于大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室，但不能用于酶動(dòng)力學(xué)分析，且無(wú)法區(qū)分內(nèi)源性與外源性β-內(nèi)酰胺酶。

四、色譜法

高效液相色譜法是目前被廣泛應(yīng)用的一種理化檢測(cè)方法，分直接法和間接法。

1.直接法。直接法是利用牛乳中的青霉素鉀或鈉在β-內(nèi)酰胺酶的作用下或堿性條件下，分解成青霉噻唑酸鉀或毒霉噻唑酸鈉，經(jīng)高效液相色譜儀檢測(cè)青霉噻唑酸鉀或毒霉噻唑酸鈉是否存在，從而判定牛奶中是否存在β-內(nèi)酰胺酶。趙靜枚等利用高效液相直接法對(duì)青霉噻唑酸進(jìn)行了定性檢測(cè)，結(jié)果表明實(shí)驗(yàn)方法簡(jiǎn)便快速，結(jié)果準(zhǔn)確。

2.間接法。間接法是利用β-內(nèi)酰胺酶能酶解青霉素的原理，在牛奶中添加一定量的青霉素，如果牛奶中存在一定濃度的β-內(nèi)酰胺酶，那么青霉素經(jīng)β-內(nèi)酰胺酶酶解后濃度會(huì)下降，通過(guò)測(cè)定青霉素的濃度從而判斷牛奶中是否存在β-內(nèi)酰胺酶。孫漢文等利用高效液相間接法建立了原乳中活性β-內(nèi)酰胺酶的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)方法，檢出限4U/毫升，加標(biāo)回收率92.3%～95.5%。

該法靈敏度高、結(jié)果準(zhǔn)確、操作時(shí)間短，但檢測(cè)成本較高，樣品前處理較煩瑣，檢測(cè)程序復(fù)雜，費(fèi)用較高，適用于精確測(cè)定，可以作為開(kāi)展仲裁檢驗(yàn)的依據(jù)。

五、其他檢測(cè)方法

隨著生物化學(xué)技術(shù)的不斷進(jìn)步，β-內(nèi)酰胺酶的檢測(cè)技術(shù)不斷發(fā)展，近年來(lái)出現(xiàn)了幾種新型的檢測(cè)方法，相較于以往的檢測(cè)方法，操作更加簡(jiǎn)便、結(jié)果更準(zhǔn)確、靈敏度更高。

1.免疫法。免疫分析法的基本原理是以抗原或半抗原和抗體特異性結(jié)合為抗原－抗體復(fù)合物的免疫反應(yīng)為基礎(chǔ)的生化測(cè)試技術(shù)。免疫分析法主要有放射免疫分析、酶免疫分析、熒光免疫分析和酶聯(lián)免疫吸附法。

姜侃等應(yīng)用氨芐青霉素抗體，人工制備氨芐青霉素和辣根過(guò)氧化物酶的結(jié)合物Amp-HRP，建立氨芐青霉素酶聯(lián)免疫檢測(cè)方法。應(yīng)用該方法分別檢測(cè)樣品反應(yīng)管和陰性對(duì)照管中氨芐青霉素，通過(guò)比較兩者OD450值，間接判斷樣品中是否含有β-內(nèi)酰胺酶。結(jié)果成功建立了酶聯(lián)免疫間接快速測(cè)定鮮乳中β-內(nèi)酰胺酶的方法，檢測(cè)靈敏度可達(dá)0.0005U/毫升。結(jié)論該方法檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確可靠，可廣泛應(yīng)用于鮮乳中β-內(nèi)酰胺酶的檢測(cè)。

張立靜等研制出快速、簡(jiǎn)便、靈敏的免疫膠體金試紙條對(duì)牛奶中的β-內(nèi)酰胺酶進(jìn)行檢測(cè)，制備該酶的單克隆和多克隆抗體，并研制出膠體金標(biāo)記的抗體，組裝并優(yōu)化免疫膠體金試紙條，結(jié)果表明確定試紙條對(duì)牛奶中TEM1的檢測(cè)限8U/毫升，雖然該試紙條的最低檢測(cè)限比文獻(xiàn)報(bào)道的微生物法的檢測(cè)限偏高，但試紙條簡(jiǎn)單、快速。

2.生物傳感器法。生物傳感器技術(shù)是利用生物化學(xué)和電化學(xué)原理，將生化反應(yīng)信號(hào)轉(zhuǎn)換為電信號(hào)，放大和模數(shù)轉(zhuǎn)換，測(cè)量出被測(cè)物質(zhì)及其濃度。生物傳感器按照所基于的特異性生物化學(xué)反應(yīng)的不同，分為酶?jìng)鞲衅骱兔庖呱飩鞲衅?。酶?jìng)鞲衅饕蕾囉诿复呋磻?yīng)的專一性，通過(guò)檢測(cè)反應(yīng)的產(chǎn)物或/和底物，得到抗生素的含量。

周爽等建立了酶熱生物傳感器法，用于快速檢測(cè)酸奶中β-內(nèi)酰胺酶。在酸奶中添加一定量青霉素G，使樣品中β-內(nèi)酰胺酶充分酶解加入的青霉素G底物，然后直接通過(guò)酶熱生物傳感器進(jìn)行分析。酶熱生物傳感器中裝備有專一性酶柱，能夠特異性地與青霉素G進(jìn)行反應(yīng)，并對(duì)其含量進(jìn)行測(cè)定。根據(jù)震蕩反應(yīng)前后酸奶樣品中青霉素G含量的變化，可以推算出酸奶樣品中β-內(nèi)酰胺酶的活性。結(jié)果表明該方法樣品檢出限為2U/毫升，定量限為4U/毫升。與傳統(tǒng)微生物法相比，該方法操作簡(jiǎn)單、儀器可便攜，顯著節(jié)約了檢測(cè)時(shí)間和成本，是傳統(tǒng)方法的有力補(bǔ)充，更適合于大規(guī)模樣品篩查和現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)。

六、小結(jié)

抗生素分解酶的出現(xiàn)及其在乳品中的非法添加而出現(xiàn)的假冒“無(wú)抗奶”是新出現(xiàn)的情況，而中國(guó)抗生素殘留檢測(cè)中尚無(wú)針對(duì)該情況的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)方法。因此，進(jìn)一步改進(jìn)牛奶中抗生素殘留的檢測(cè)方法，增加抗生素分解酶的檢測(cè)，逐步完善中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)方法，對(duì)食品安全和奶牛疾病防控等均具有重要意義。