唐夢丹 鄭建峰 沈亮亮 姜淼 趙敬軍

我國不同地域煙曲霉臨床分離株CSP基因型及對抗真菌藥物的敏感性分析

唐夢丹 鄭建峰 沈亮亮 姜淼 趙敬軍

目的探討我國不同地域致病煙曲霉臨床分離株CSP基因型分布情況,以及不同地域、不同CSP基因型煙曲霉藥物敏感性有無差異。方法對福建、上海、河北及北京四地臨床分離到的112株煙曲霉分別通過形態(tài)學(xué)、溫度試驗(yàn)及β微管蛋白分子生物學(xué)測序鑒定,再對煙曲霉進(jìn)行CSP基因分型,同時用M38-A方法測定伏立康唑、伊曲康唑及兩性霉素B對不同型別煙曲霉的最低抑菌濃度(MIC)。結(jié)果112株曲霉均鑒定為經(jīng)典煙曲霉,共確定11個CSP基因型,其中t04A、t03、t01最多見,分別為32株、17株、24株。福建分離株以t10、t04A、t01最常見,上海分離株以t04A、t01最常見,河北分離株以t01、t03、t04A最常見,北京分離株以t02、t04A、t01和t03最常見,t25為1個新CSP基因分型,新基因型菌株的菌落形態(tài)、生長速度、最適生長溫度與其他菌株并無顯著差別。不同CSP基因型煙曲霉對抗真菌藥物敏感性差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,但福建地區(qū)分離株對伊曲康唑的MIC值低于其他三地的分離株。結(jié)論煙曲霉臨床株CSP基因型存在一定的地域特點(diǎn),不同基因型的煙曲霉對抗真菌藥物的敏感性差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,而不同地域來源煙曲霉對伊曲康唑敏感性存在差異。

曲霉菌,煙;微管蛋白;基因型

煙曲霉(Aspergillus fumigatus)是侵襲性曲霉病最主要的致病菌。煙曲霉復(fù)合體包含25個不同種的菌,其中8個無性型,17個有性型。一些新的菌種如A.lentulus、A.udagawae、Neorsartorya fischeri、N.pseudofischeri也可以致病［1］,但其菌落形態(tài)及鏡下形態(tài)都與經(jīng)典煙曲霉極為相似,往往不容易區(qū)分,因此,正確的菌種鑒定依賴于溫度試驗(yàn)及分子生物學(xué)手段。不同煙曲霉復(fù)合體分支最高生長溫度不同,經(jīng)典煙曲霉最高生長溫度為48℃以上,而A.lentulus、A.udagawae最高生長溫度分別為45℃和42℃［2］。不同分支的煙曲霉對抗真菌藥物的敏感性不同,有些菌株如A.lentulus、A.udagawae已開始出現(xiàn)耐藥［3］。CSP分型是目前可以用于經(jīng)典煙曲霉的國際標(biāo)準(zhǔn)化命名體系,已經(jīng)在國內(nèi)外得到公認(rèn)。CSP基因分型是對煙曲霉細(xì)胞表面蛋白(cell surface protein)編碼基因進(jìn)行擴(kuò)增測序,利用其編碼區(qū)域內(nèi)的串聯(lián)重復(fù)序列多態(tài)性進(jìn)行分型［4-7］。本研究旨在對福建、上海、河北及北京四地臨床分離的煙曲霉進(jìn)行形態(tài)學(xué)、溫度試驗(yàn)及分子生物學(xué)鑒定,再對煙曲霉進(jìn)行CSP基因分型,同時用M38-A方法測定伏立康唑、伊曲康唑及兩性霉素B對不同型別煙曲霉的最低抑菌濃度(MIC),以探討不同地區(qū)煙曲霉CSP型別的分布特點(diǎn)、不同基因型煙曲霉與抗真菌藥敏感性的關(guān)系,同時探討不同地區(qū)煙曲霉對抗真菌藥物的敏感性是否存在差異。

對象與方法

一、菌株來源

本研究收集了112株不同地域臨床分離到的煙曲霉,分別來自于北京(28株)、上海(24株)、福建(34株)及河北(26株)。其中104株分離于痰液,4株分離于鼻旁竇,另外皮膚、角膜、膿性分泌物及膽汁各分離到1株。

二、方法

1.形態(tài)學(xué)鑒定:把菌株點(diǎn)植在馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA)37℃培養(yǎng)3～7 d,每日觀察并記錄菌株生長情況,包括菌落大小、顏色、形狀、生長速度和質(zhì)地,同時行KOH和乳酸酚棉藍(lán)染色觀察鏡下孢子形態(tài),頂囊范圍、層數(shù)等。

2.溫度生長試驗(yàn):將鑒定出的煙曲霉菌株分別置于25℃、37℃和48℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3～7 d,觀察菌落是否生長。

3.分子生物學(xué)試驗(yàn):采用玻璃珠法提取煙曲霉基因組DNA［8］。對β微管蛋白進(jìn)行PCR擴(kuò)增后,取40 μl PCR產(chǎn)物及上游引物送往上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行單向測序,測序結(jié)果在Genbank上用BLAST軟件進(jìn)行比對。

4.CSP基因分型:對鑒定出的經(jīng)典煙曲霉進(jìn)行CSP基因擴(kuò)增測序后［4］,在其堿基序列中使用Microsoft Word的查找與替代功能尋找重復(fù)單位,明確其連接順序,并利用mega5.0軟件查找其重復(fù)區(qū)域上游第 1、14、15及下游第 1、2、3密碼子突變類型,根據(jù)國際標(biāo)準(zhǔn)化分型命名進(jìn)行分型［4］。

5.藥物敏感性試驗(yàn):參照2003年美國臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(NCCLS)制定的產(chǎn)孢絲狀真菌抗真菌藥物敏感性試驗(yàn)方案M38-A進(jìn)行［9］。以煙曲霉ATCC204305、近平滑念珠菌ATCC22019作為質(zhì)控菌株,測定臨床分離到的煙曲霉對伏立康唑、伊曲康唑、兩性霉素B的MIC。每次試驗(yàn)時同時進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)株的敏感性測定,每次結(jié)果顯示其MIC總介于同一范圍、且各藥物每次測定的MIC波動不超過1個稀釋度方認(rèn)為試驗(yàn)操作無誤。

6.統(tǒng)計(jì)學(xué)方法:采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件包對不同CSP型別、不同地區(qū)煙曲霉的MIC進(jìn)行Kruskal-Wallis秩和檢驗(yàn)。

結(jié) 果

一、曲霉的形態(tài)學(xué)及測序鑒定結(jié)果

112株曲霉經(jīng)培養(yǎng)及乳酸酚棉藍(lán)染色后鏡下觀察,均為煙曲霉;112株煙曲霉在48℃時均能生長,支持為經(jīng)典煙曲霉;通過β微管蛋白序列鑒定,均能將曲霉鑒定到種,與Genbank中經(jīng)典煙曲霉序列比對,呈現(xiàn)98%以上一致性,證實(shí)均為經(jīng)典煙曲霉。

二、煙曲霉的CSP基因分型結(jié)果

對4個地區(qū)的煙曲霉臨床分離株進(jìn)行CSP分型,共分為11型。其中t25基因型為新CSP分型,此煙曲霉來自福建,分離自膿液。t04A、t03和t01為最常見3種基因型,其中福建分離株以t10、t04A、t01為常見,上海分離株以t04A、t01為常見,河北分離株以t01、t03、t04A 為常見,北京分離株以 t02、t04A、t01和t03為常見,另外t02主要分離自河北、北京,而t10主要分離自福建(表1)。對新發(fā)現(xiàn)的t25型菌株進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn),其菌落形態(tài)、生長速度、最適生長溫度與其他菌株并無顯著差別。

三、不同基因型及不同地區(qū)煙曲霉臨床分離株藥敏試驗(yàn)結(jié)果

112株煙曲霉分離株的MIC范圍見表2,伏立康唑?yàn)?.125～1 mg/L,伊曲康唑?yàn)?.125～2 mg/L,兩性霉素B為0.125～4 mg/L。7種基因型的煙曲霉對伏立康唑、伊曲康唑及兩性霉素B的敏感性差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P＞0.05)。t06A、t17、t18B因只有2株,t25只有1株,未進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)比較。福建分離株對伊曲康唑的敏感性最高,與上海、河北及北京的分離株比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);而4個地區(qū)菌株對伏立康唑、兩性霉素B的敏感性差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P＞0.05)。

表2 3種抗真菌藥對不同地域及不同基因型煙曲霉的最低抑菌濃度(MIC)范圍(mg/L)

討 論

曲霉的準(zhǔn)確鑒定和分型是曲霉屬系統(tǒng)發(fā)生學(xué)的基礎(chǔ),同時對曲霉感染的實(shí)驗(yàn)室診斷和流行病學(xué)調(diào)查具有重要意義。煙曲霉不同分支的菌落和鏡下形態(tài)特征極為相似,僅憑形態(tài)學(xué)往往難以區(qū)分。研究顯示,利用β微管蛋白基因(β-tubulin)、鈣調(diào)蛋白基因、Rodlet A的序列分析可以將曲霉鑒定到種［10］。煙曲霉不同分支對抗真菌藥物的敏感性不同,有臨床研究發(fā)現(xiàn),煙曲霉復(fù)合體的一些菌株對唑類和兩性霉素B等抗真菌藥物出現(xiàn)了耐藥［11-12］。因此,在臨床工作中,準(zhǔn)確鑒定煙曲霉相關(guān)菌株,對于指導(dǎo)抗真菌藥物的選擇,改善患者預(yù)后具有重要意義。我們對北京、上海、福建及河北多家醫(yī)院臨床分離到的112株煙曲霉進(jìn)行形態(tài)學(xué)、溫度試驗(yàn)及β微管蛋白序列分析,證實(shí)我們收集的臨床分離株均為經(jīng)典煙曲霉,且未發(fā)現(xiàn)這些菌株常見生物學(xué)性狀的差異,與李若瑜等［7］研究結(jié)果一致。

CSP基因多態(tài)性在于其編碼區(qū)內(nèi)重復(fù)單位不同的順序和數(shù)目變化及重復(fù)區(qū)域兩側(cè)的點(diǎn)突變。雖然有相關(guān)研究表明,CSP基因分型的分辨率不如微衛(wèi)星序列分型,但其有簡便、快速、無需特殊軟件處理等優(yōu)勢［5］。 最早 Klaassen 等［6］對荷蘭不同醫(yī)院分離到的209株煙曲霉進(jìn)行CSP基因分型,發(fā)現(xiàn)了19個基因型。同年Kidd等［4］對澳大利亞的164株煙曲霉進(jìn)行CSP分型增補(bǔ)至22個基因型。李若瑜等［7］對北京大學(xué)真菌病研究中心保存分離自125例患者的162株煙曲霉臨床株進(jìn)行CSP分型,分為16型,且發(fā)現(xiàn)了5個新的基因型,使CSP基因型分型增至27個。本研究中對4個地區(qū)臨床分離到的112株經(jīng)典煙曲霉進(jìn)行CSP分型,分為11型,其中1個為新型t25。通過對發(fā)現(xiàn)的新基因型菌株進(jìn)行生物學(xué)特性研究,發(fā)現(xiàn)其菌落形態(tài)、生長速度、最適生長溫度與其他菌株并無顯著差別。另外t02主要分離自河北、北京,而t10主要來自福建,而且從福建分離到的煙曲霉中發(fā)現(xiàn)有12株t10型,t10占福建總株數(shù)的35.29%,這些結(jié)果在一定程度上提示,不同地區(qū)可能存在不同的流行菌株。如果我們從更多地區(qū)分離更多煙曲霉菌株進(jìn)行深入研究,將可以更好地反映我國境內(nèi)煙曲霉菌株CSP分型及其分布情況。另外致病菌株與環(huán)境菌株的關(guān)系國外也有研究報道,Leenders等［13］對荷蘭鹿特丹大學(xué)醫(yī)院院內(nèi)和周圍環(huán)境中的煙曲霉分布進(jìn)行了長達(dá)14個月的研究,證實(shí)血液病病房致病煙曲霉菌株與環(huán)境中持續(xù)存在達(dá)1年以上的菌株有關(guān)。后續(xù)研究我們有必要收集多家醫(yī)院院內(nèi)和周圍環(huán)境空氣中的煙曲霉進(jìn)行CSP基因分型比較研究。

我們在進(jìn)行煙曲霉的藥物敏感性測定中,判定點(diǎn)采用兩性霉素B MIC＞8 mg/L,唑類藥物MIC＞2 mg/L即為耐藥［14］。我們對不同CSP型別的煙曲霉菌株進(jìn)行比較,未發(fā)現(xiàn)不同CSP類型煙曲霉對伏立康唑、伊曲康唑及兩性霉素B敏感性存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,而且新發(fā)現(xiàn)的t25菌株對這3種藥物不存在耐藥情況。同時通過對4地臨床分離到的煙曲霉MIC進(jìn)行比較,發(fā)現(xiàn)以福建地區(qū)分離株對伊曲康唑的MIC最低,可能與不同地區(qū)臨床對唑類藥物的使用頻率、醫(yī)務(wù)人員使用伊曲康唑預(yù)防用藥有一定關(guān)系。

志謝北京大學(xué)第一醫(yī)院皮膚科,復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院皮膚科真菌室,河北醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院皮膚科,福建醫(yī)科大學(xué)附屬協(xié)和醫(yī)院檢驗(yàn)科提供研究用煙曲霉

［1］Balajee SA，Gribskov J，Brandt M，et al.Mistaken identity:Neosartorya pseudofischeri and its anamorph masquerading asAspergillus fumigatus［J］.J Clin Microbiol，2005，43(12):5996-5999.

［2］Yaguchi T，Horie Y，Tanaka R，et al.Molecular phylogenetics of multiple genes onAspergillussectionFumigatiisolated from clinical specimens in Japan［J］.Nippon Ishinkin Gakkai Zasshi，2007，48(1):37-46.

［3］Alcazar-Fuoli L，Mellado E，Alastruey-Izquierdo A，et al.AspergillussectionFumigati:antifungal susceptibility patterns and sequencebased identification［J］.Antimicrob Agents Chemother，2008，52(4):1244-1251.

［4］Kidd SE1，Nik Zulkepeli NA，Slavin MA，et al.Utility of a proposed CSP typing nomenclature for AustralianAspergillus fumigatusisolates:Identification of additional CSP types and suggested modifications［J］.J Microbiol Methods，2009，78(2):223-226.

［5］Balajee SA，de Valk HA，Lasker BA ，et al.Utility of a microsatellite assay for identifying clonally related outbreak isolates ofAspergillus fumigatus［J］.J Microbiol Methods，2008，73(3):252-256.

［6］Klaassen CH，de Valk HA，Blaljee SA，et al.Utiluty of CSP typing to sub-type clinicalAspergillus fumigatusisolates and proposal for a new CSP type nomenclature ［J］.J Microbiol Methods，2009，77(3):292-296.

［7］高露娟，余進(jìn)，李若瑜.煙曲霉再鑒定、標(biāo)準(zhǔn)化CSP分型及體外藥物敏感性［J］.中國真菌學(xué)雜志，2011，6(6):328-331，336.

［8］Oh BH1，Song YC，Lee YW，et al.Comparison of nested PCR and RFLP for identification and classification of malassezia yeasts from healthy human skin［J］.Ann Dermatol，2009，21(4):352-357.

［9］National Committee for Clinical Laboratory Standards，2002.Reference method for broth dilution antifungal susceptibility testing of filamentous fungi approved standard.NCCLS document M38-A ［J］.Clinicaland Laboratory Standards Institute，Villanova，Pa.

［10］Varga J，Houbraken J，Van Der Lee HA，et al.Aspergillus calidoustussp.nov.，causative agentofhuman infections previously assigned toAspergillus ustus［J］.Eukaryot Cell，2008，7(4):630-638.

［11］Burgel PR，Baixench MT，Amsellem M，et al.High prevalence of azole-resistantAspergillus fumigatusin adults with cystic fibrosis exposedto itraconazole［J］.Antimicrob Agents Chemother，2012，56(2):869-874.

［12］Colozza C，Posteraro B，Santilli S，et al.In vitroactivities of amphotericin B and AmBisome againstAspergillusisolates recovered from Italian patients treated for haematological malignancies［J］.Int J Antimicrob Agents，2012，39(5):440-443.

［13］Leenders AC，van Belkum A，Behrendt M，et al.Density and molecular epidemiology ofAspergillusin air and relationship to outbreaks ofAspergillusinfection［J］.J Clin Microbiol，1999,37(6):1752-1757.

［14］verweij PE，Howard SJ，Melchers WJ，et al.Azole-resistance inAspergillus:proposed nomenclature and breakpoints ［J］.Drug Resist Updat，2009，12(6):141-147.

CSP genotypes and antifungal susceptibility ofAspergillus fumigatusisolates from clinical settings in different regions of China

Tang Mengdan*，Zheng Jianfeng，Shen Liangliang，Jiang Miao，Zhao Jingjun.*Department of Dermatology，Tongji Hospital，Tongji University，Shanghai 200065，China

Zhao Jingjun，Email:zhaomyco@163.com

Objective To describe the CSP genotypic profile in clinical isolates ofAspergillus fumigatesfrom different regions of China，and to investigate if there is a difference in antifungal susceptibility amongA.fumigatesof different CSP genotypes and from different regions.Methods Totally，112A.fumigatesstrains clinically isolated from Fujian，Shanghai，Hebei and Beijing were included in this study，and identified according to macro-and micro-morphological characters，growth temperature and β-tubulin sequence.ClassicA.fumigatusstrains were typed according to CSP gene sequence.The minimal inhibitory concentrations(MICs)of voriconazole，itraconazole and amphotericin B toA.fumigateswere determined in accordance with the National Committee for Clinical Laboratory Standards(NCCLS)M38-A protocol.Results All the strains were identified as classicA.fumigates，and fall into 11 CSP genotypes.The most common genotypes were t04A(n=32)，t03(n=17)and t01(n=24)in all the strains，t10，t04A and t01 in Fujian，t04A and t01 in Shanghai，t01，t03 and t04A in Hebei，t02，t04A，t01and t03 in Beijing.OneA.fumigatusstrain was identified as a new CSP type t25 in Fujian，which showed no obvious difference in morphology，growth rate or appropriate growth temperature from the other CSP genotypes ofA.fumigatusstrains.No statistical difference was found in the susceptibility to amphotericin B，itraconazole or fluconazole among different genotypes ofA.fumigates，whereas the MICs of itraconazole were significantly lower inA.fumigatesisolates from Fujian than in those from the other three regions.Conclusions The CSP genotypic profile ofA.fumigatesvaries in clinical isolates from different regions.No significant difference is observed in the susceptibility to amphotericin B，itraconazole or fluconazole among different CSP genotypes ofA.fumigates，but the susceptibility to itraconazole is somewhat different betweenA.fumigatesstrains from different regions.

Aspergillus fumigatus；Tubulin；Genotype

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2014.08.006

國家自然科學(xué)基金(81071329)

200065上海,同濟(jì)大學(xué)附屬同濟(jì)醫(yī)院皮膚科(唐夢丹、沈亮亮、姜淼、趙敬軍);福建醫(yī)科大學(xué)協(xié)和臨床醫(yī)學(xué)院(鄭建峰)

趙敬軍,Email:zhaomyco@163.com

2013-08-09)

(本文編輯:顏艷)