賈鵬禹等

摘 要 采用雙三元液相色譜（Dual gradient liquid chromatography，DGLC）建立了在線固相萃取技術(shù)與電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用方法（Online SPE DGLCESI MS/MS），并成功應(yīng)用于實(shí)際樣品檢測(cè)。本方法同時(shí)檢測(cè)大豆不同部位中的4種酸堿性植物激素（赤霉素（GA3）、吲哚乙酸（IAA）、玉米素（ZT）和脫落酸（ABA））。通過考察固相萃取富集柱、分析色譜柱、流動(dòng)相對(duì)植物激素的保留和選擇性的影響，獲得較高的靈敏度、回收率、穩(wěn)定性及精密度。大豆樣品經(jīng)液氮低溫研磨，以80%甲醇溶液提取，再經(jīng)離心稀釋過濾后，進(jìn)樣分析。進(jìn)樣后樣品經(jīng)在線固相萃取Hypersep Retain AX柱洗脫保留，目標(biāo)分析物依次轉(zhuǎn)移至分析柱Acclaim PA2色譜柱，并以0.1%甲酸和甲醇溶液作為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫，采用選擇反應(yīng)監(jiān)測(cè)離子模式（SRM）同時(shí)采集正負(fù)離子通道進(jìn)行定性分析，基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線外標(biāo)法進(jìn)行定量分析，GA3， IAA， ZT在0.1～50 μg/L 范圍內(nèi)線性良好，檢出限為0.0002 μg/g； ABA在0.5～50 μg/L的范圍內(nèi)線性良好，其檢出限為0.0010 μg/g。以0.8， 4.0和40 μg/L分別為低、中、高濃度考察4種植物激素的回收率為76.1%～93.5%，RSD為0.8%～6.0%。結(jié)果表明，籽粒中含有的ABA濃度明顯高于其它部位。本研究為快速準(zhǔn)確地分離和測(cè)定大豆不同部位內(nèi)源激素提供了有效方法。

4 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)建立了雙三元液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定大豆不同部位的內(nèi)源激素在線固相萃取液質(zhì)聯(lián)用分析方法。在滿足常規(guī)分析的同時(shí)，針對(duì)本實(shí)驗(yàn)中遇到的基質(zhì)干擾大、樣品前處理復(fù)雜、重現(xiàn)性差、目標(biāo)分析物含量低等問題通過Online SPE技術(shù)在線除雜富集解決，有較多成熟的應(yīng)用[15，16]。

通過與已發(fā)表的關(guān)于植物激素研究的文獻(xiàn)比較[11，12]，本方法的檢測(cè)限有明顯優(yōu)勢(shì)，通過選擇合適的SPE柱，保證不同性質(zhì)的植物激素可以同時(shí)保留，與基質(zhì)分離，一次進(jìn)樣同時(shí)檢測(cè)酸堿性植物激素，檢測(cè)結(jié)果更加全面，提高了檢測(cè)效率。 文獻(xiàn)[17]采用HPLC方法分析大豆中的植物激素， GA3檢出限為0.5 μg/g，樣品未檢出，ABA含量明顯高于其它成分。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與文獻(xiàn)[17]相符。 本方法樣品前處理簡(jiǎn)單方便，靈敏度高，固相萃取在線分析技術(shù)是一種高通量，快速的植物內(nèi)源激素檢測(cè)技術(shù)，檢出限完全能滿足農(nóng)業(yè)科學(xué)研究需要。被測(cè)組分提取、濃縮、分離的在線進(jìn)行，不僅省時(shí)而且改善了檢出限；而且具有抗化學(xué)干擾、可靠性好的優(yōu)點(diǎn)，特別適用于復(fù)雜基質(zhì)中低含量組分的檢出。本方法將有望廣泛地應(yīng)用于農(nóng)業(yè)科學(xué)領(lǐng)域生理生化指標(biāo)中被測(cè)物的高靈敏度、高準(zhǔn)確度檢測(cè)。

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15 Liu R， Ruan T， Wang T， Song S， Guo F， Jiang G. Talanta， 2014， 120： 158-166

16 Zeng M F， Zhang J， Yang Y F， Jin Y， Xiao W， Wang Z， Ding G， Yan R. J Pharm Biomed Anal.， 2014， 88： 354-363

17 ZHANG XiuHong， WANG WenRui， XU XiaoFeng， BAO YuLong. Chinese Journal of Health Laboratory Technology.， 2012， 22（12）： 2825-2826

張秀紅， 王文瑞 ， 徐曉楓， 包玉龍. 中國(guó)衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志， 2012， 22（12）： 2825-2826

An Automated Dualgradient Liquid Chromatography

MS/MS Method for Simultaneous Determination of

Four Kinds of Plants Hormones in Different Parts of

Soya Beans and Its Application to a Real Analysis

JIA PengYu1， ZENG MingFei2， FENG NaiJie1， ZHENG DianFeng*1， SUN FuDong1， SUN Rui1， LI ChaoYang1

1（Heilongjiang Bayi Agricultural University， Daqing 163319， China）

2（Thermofisher Scientific Corporation， Shanghai 201203， China）

Abstract There are some common analysis challenges in the hormone detection in agriculture science， including matrix interference， complicated sample preparation， poor reproducibility， trace analyte content. An automated online SPE and innovative fast polarity switch analysis method employing dualgradient liquid chromatography （DGLC） coupled with tandem mass spectrometry （DGLCMS/MS） was established and validated for the simultaneous determination of gibberellic acid （GA3）， indole acetic acid （IAA）， zeatin （ZT） and abscisic acid （ABA） in the soybean plant （leaf， grain and pod）. The method was applied in the actual sample detection successfully. In order to acquire higher sensitivity， recovery， stability and precision， some conditions including SPE column， analytical column， mobile phase， additive etc were optimized according to the selection and retain of hormone. Beans were cryogenically grinded by liquid nitrogen， extracted by 80% methanol， certrifugatel and dilluted with water， and then injected directly. Samples were transported and gradient eluted on the analytical column Acclaim PA2 by 0.1% formic acid in water and methanol， after retaining and separation on the SPE column Hypersep Retain AX. All analytes were detected in selection reaction monitoring （SRM） mode in both positive and negative channels. The quantification was based on linear regression. The linear ranges of GA3， IAA and ZT were 0.1-50 μg/L with the LOQ of 0.0002 μg/g， and the linear of ABA was 0.5-50 μg/L with the LOQ of 0.0010 μg/g. The recoveries of four kinds of plants hormones were 76.1%-93.5%， and RSDs were 0.82%-6.02% at low （0.8 μg/L）， medium （4.0 μg/L） and high （40 μg/L）. The results noted that the content of ABA in seeds was apparently higher than others. This method could be used for the rapid and accurate detection of hormone in different parts of soya beans.

Keywords Phytohormone； Soya Beans； Dualgradient liquid chromatographytandem mass spectrometry； Online solid phase extraction

（Received 18 August 2014； accepted 17 September 2014）

This work was supported by the National Natural Science Foundation of China （Nos. 31171503， 31271652

鐘冬蓮， 丁 明， 湯富彬， 莫潤(rùn)宏， 滕 瑩. 分析化學(xué)， 2013， 41（11）： 1739-1743

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張秀紅， 王文瑞 ， 徐曉楓， 包玉龍. 中國(guó)衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志， 2012， 22（12）： 2825-2826

An Automated Dualgradient Liquid Chromatography

MS/MS Method for Simultaneous Determination of

Four Kinds of Plants Hormones in Different Parts of

Soya Beans and Its Application to a Real Analysis

JIA PengYu1， ZENG MingFei2， FENG NaiJie1， ZHENG DianFeng*1， SUN FuDong1， SUN Rui1， LI ChaoYang1

1（Heilongjiang Bayi Agricultural University， Daqing 163319， China）

2（Thermofisher Scientific Corporation， Shanghai 201203， China）

Abstract There are some common analysis challenges in the hormone detection in agriculture science， including matrix interference， complicated sample preparation， poor reproducibility， trace analyte content. An automated online SPE and innovative fast polarity switch analysis method employing dualgradient liquid chromatography （DGLC） coupled with tandem mass spectrometry （DGLCMS/MS） was established and validated for the simultaneous determination of gibberellic acid （GA3）， indole acetic acid （IAA）， zeatin （ZT） and abscisic acid （ABA） in the soybean plant （leaf， grain and pod）. The method was applied in the actual sample detection successfully. In order to acquire higher sensitivity， recovery， stability and precision， some conditions including SPE column， analytical column， mobile phase， additive etc were optimized according to the selection and retain of hormone. Beans were cryogenically grinded by liquid nitrogen， extracted by 80% methanol， certrifugatel and dilluted with water， and then injected directly. Samples were transported and gradient eluted on the analytical column Acclaim PA2 by 0.1% formic acid in water and methanol， after retaining and separation on the SPE column Hypersep Retain AX. All analytes were detected in selection reaction monitoring （SRM） mode in both positive and negative channels. The quantification was based on linear regression. The linear ranges of GA3， IAA and ZT were 0.1-50 μg/L with the LOQ of 0.0002 μg/g， and the linear of ABA was 0.5-50 μg/L with the LOQ of 0.0010 μg/g. The recoveries of four kinds of plants hormones were 76.1%-93.5%， and RSDs were 0.82%-6.02% at low （0.8 μg/L）， medium （4.0 μg/L） and high （40 μg/L）. The results noted that the content of ABA in seeds was apparently higher than others. This method could be used for the rapid and accurate detection of hormone in different parts of soya beans.

Keywords Phytohormone； Soya Beans； Dualgradient liquid chromatographytandem mass spectrometry； Online solid phase extraction

（Received 18 August 2014； accepted 17 September 2014）

This work was supported by the National Natural Science Foundation of China （Nos. 31171503， 31271652

鐘冬蓮， 丁 明， 湯富彬， 莫潤(rùn)宏， 滕 瑩. 分析化學(xué)， 2013， 41（11）： 1739-1743

11 Hou S J， Zhu J， Ding M Y， Lv G H. Talanta， 2008， 76（4）： 798-802

12 Novak O， Hauserova E， Amakorova P， Dolezal K， Strnad M. Phytochemistry， 2008， 69（11）： 2214-2224

13 Liu S， Chen W， Qu L， Gai Y， Jiang X. Anal Bioanal Chem， 2013， 405（29）： 1257-1266

14 Fan S， Wang X， Li P， Zhang Q， Zhang W. J SEP SCI， 2011， 34（6）： 640-650

15 Liu R， Ruan T， Wang T， Song S， Guo F， Jiang G. Talanta， 2014， 120： 158-166

16 Zeng M F， Zhang J， Yang Y F， Jin Y， Xiao W， Wang Z， Ding G， Yan R. J Pharm Biomed Anal.， 2014， 88： 354-363

17 ZHANG XiuHong， WANG WenRui， XU XiaoFeng， BAO YuLong. Chinese Journal of Health Laboratory Technology.， 2012， 22（12）： 2825-2826

張秀紅， 王文瑞 ， 徐曉楓， 包玉龍. 中國(guó)衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志， 2012， 22（12）： 2825-2826

An Automated Dualgradient Liquid Chromatography

MS/MS Method for Simultaneous Determination of

Four Kinds of Plants Hormones in Different Parts of

Soya Beans and Its Application to a Real Analysis

JIA PengYu1， ZENG MingFei2， FENG NaiJie1， ZHENG DianFeng*1， SUN FuDong1， SUN Rui1， LI ChaoYang1

1（Heilongjiang Bayi Agricultural University， Daqing 163319， China）

2（Thermofisher Scientific Corporation， Shanghai 201203， China）

Abstract There are some common analysis challenges in the hormone detection in agriculture science， including matrix interference， complicated sample preparation， poor reproducibility， trace analyte content. An automated online SPE and innovative fast polarity switch analysis method employing dualgradient liquid chromatography （DGLC） coupled with tandem mass spectrometry （DGLCMS/MS） was established and validated for the simultaneous determination of gibberellic acid （GA3）， indole acetic acid （IAA）， zeatin （ZT） and abscisic acid （ABA） in the soybean plant （leaf， grain and pod）. The method was applied in the actual sample detection successfully. In order to acquire higher sensitivity， recovery， stability and precision， some conditions including SPE column， analytical column， mobile phase， additive etc were optimized according to the selection and retain of hormone. Beans were cryogenically grinded by liquid nitrogen， extracted by 80% methanol， certrifugatel and dilluted with water， and then injected directly. Samples were transported and gradient eluted on the analytical column Acclaim PA2 by 0.1% formic acid in water and methanol， after retaining and separation on the SPE column Hypersep Retain AX. All analytes were detected in selection reaction monitoring （SRM） mode in both positive and negative channels. The quantification was based on linear regression. The linear ranges of GA3， IAA and ZT were 0.1-50 μg/L with the LOQ of 0.0002 μg/g， and the linear of ABA was 0.5-50 μg/L with the LOQ of 0.0010 μg/g. The recoveries of four kinds of plants hormones were 76.1%-93.5%， and RSDs were 0.82%-6.02% at low （0.8 μg/L）， medium （4.0 μg/L） and high （40 μg/L）. The results noted that the content of ABA in seeds was apparently higher than others. This method could be used for the rapid and accurate detection of hormone in different parts of soya beans.

Keywords Phytohormone； Soya Beans； Dualgradient liquid chromatographytandem mass spectrometry； Online solid phase extraction

（Received 18 August 2014； accepted 17 September 2014）

This work was supported by the National Natural Science Foundation of China （Nos. 31171503， 31271652