于水瀾，于英君，許曉義，關(guān)利新，劉佳維，朱雁飛，宋高臣

(1．黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040;2．牡丹江醫(yī)學(xué)院，黑龍江 牡丹江 157011)

半枝蓮(Scutellaria barbata D．Don)為唇形科黃芩屬植物，味辛、微苦，性寒，歸肺、肝、腎經(jīng)，具有清熱解毒，散癖止血，利尿消腫、抗癌等功效［1］，是中醫(yī)處方和成藥中的常用中藥。近代藥理學(xué)研究表明，半枝蓮具有抗腫瘤［2－4］、抗氧化［5］、抗病毒［6］、抑菌［7］、解熱［8］、保肝［9］等活性。半枝蓮作為一種常用的抗腫瘤中藥，現(xiàn)代在臨床上應(yīng)用于治療肝癌、胃癌、肺癌、直腸癌、鼻咽癌等且療效確切［10］。其中半枝蓮多糖(SB-PS)是從半枝蓮中分離的主要功能性成分之一。

本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)中的2－DE與圖像分析技術(shù)，將SBPS作用H22肝癌小鼠后的血清與腫瘤組血清分別進(jìn)行分離和比較分析，通過比對(duì)分析找出差異表達(dá)的蛋白，為進(jìn)一步篩選出SBPS抑制腫瘤活性的靶位蛋白奠定基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1．1 動(dòng)物與廇株

昆明種小鼠20只，體質(zhì)量(20±2．0)g，雌雄各半，由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供;小鼠轉(zhuǎn)移性腹水型肝癌細(xì)胞株(H22)，由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤研究所引進(jìn)。

1．2 主要試劑

半枝蓮多糖(寧波德康生物制品有限公司);固相pH梯度干膠條(7cm，pH值3～10);固相pH梯度干膠條(18cm，pH 值4～7);IPG Buffer、覆蓋液、等電點(diǎn)標(biāo)準(zhǔn)、甘油(Glycerol);2D Qunat Kit蛋白定量試劑盒、溴酚藍(lán)(Bromophenol blue)均由 GE Amersham Biosiences公司提供;ProteoExtractTMAlbumin/IgG Removal Kit(Calbiochem 公司);DTT、IAM、TEMED、CHAPS、β－巰基乙醇等(Sigma公司);其他試劑均為標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)試劑。

1．3 主要儀器

680 分光光度計(jì)(Bio－Rad公司);3K15高速離心機(jī)(Sigma公司);純水裝置(Millpore公司);Ettan DALT twelve system電泳儀、Ettan IPGphor3等點(diǎn)聚焦儀、ImageMaster 5．0 分析軟件(GE Amersham Biosiences公司);PowerLook 2100XL掃描儀(UMAX Powerlook公司)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2．1 H22肝癌小鼠實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ徒⑴c分組

無菌條件下抽取接種第6～7天的生長良好的H22肝癌小鼠的腹水(活癌細(xì)胞數(shù)＞97%)，生理鹽水1:3稀釋，0．2%臺(tái)盼藍(lán)染色，計(jì)活細(xì)胞數(shù)大于95%，無菌操作小鼠右前肢腋部皮下接種0．2mL/只制備實(shí)體瘤模型。將接種H22細(xì)胞的實(shí)體瘤小鼠隨機(jī)分為兩組，每組10只，分別為腫瘤組和SBPS組。于接種6h后開始腹腔注射給藥，SBPS組100mg/(kg·d)，腫瘤組小鼠給予同體積的生理鹽水。每日1次，直到腫瘤組腫瘤達(dá)到lg以上。

2．2 血清樣品制備

小鼠摘眼球取血，取完血后4℃靜置30min，然后以3000g離心20～30min，取上清，同組血清樣品混合后，分別將兩組血清分裝置于－80℃冰箱保存。利用ProteoPrep Blue Albumin and IgG Depletion Kit對(duì)血漿樣品進(jìn)行去除白蛋白和免疫球蛋白(實(shí)驗(yàn)步驟按照操作說明書)。用2－D Quant Kit進(jìn)行蛋白濃度測定(實(shí)驗(yàn)步驟按照操作說明書)，得上清液為蛋白樣本。

2．3 雙向凝膠電泳

雙向凝膠電泳(2－DE)操作步驟按應(yīng)其使用說明進(jìn)行;取兩組小鼠血清(SBPS組和腫瘤組)蛋白樣品，進(jìn)行第一向固相pH梯度等電聚焦，平衡膠條，再進(jìn)行第二向SDS－PAGE電泳，重復(fù)兩次。

2．4 圖像掃描及分析

雙向電泳凝膠采用UMAX公司的PowerLook 2100XL掃描儀進(jìn)行掃描，運(yùn)用GE Amersham公司的ImageMaster 5．0軟件對(duì)凝膠數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

2．5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS 13．0軟件，組間蛋白的差異點(diǎn)采用卡方檢驗(yàn)，組間蛋白點(diǎn)匹配率的比較采用T－test檢驗(yàn)。

3 結(jié)果

3．1 血清2－DE的重復(fù)性

在相同條件下，分別對(duì)腫瘤組和SBPS組血清進(jìn)行兩次2－DE圖譜的重復(fù)性匹配分析，腫瘤組和SBPS組兩塊膠圖斑點(diǎn)的匹配率分別為99.85%和99.81%，此實(shí)驗(yàn)可獲得重復(fù)性較好的血清2－DE圖譜。

3．2 腫瘤組和SBPS組血清的2－DE圖譜

腫瘤組和SBPS組血清的2－DE圖譜(見圖1)總蛋白質(zhì)點(diǎn)分別為(335±3)、(252±7)個(gè)。應(yīng)用 ImageMaster 5．0軟件分別對(duì)兩組2－DE圖譜進(jìn)行匹配分析后，腫瘤組與SBPS組間蛋白表達(dá)差異3倍以上的點(diǎn)共有18個(gè)(見圖2)，其中在SBPS組中6個(gè)蛋白點(diǎn)表達(dá)上調(diào)，1個(gè)蛋白點(diǎn)表達(dá)下調(diào)，1個(gè)蛋白點(diǎn)在SBPS組特異表達(dá)，10個(gè)蛋白點(diǎn)在SBPS組表達(dá)缺失，如表1～2所示。

表1 腫瘤組與SBPS組表達(dá)量相差3倍以上的蛋白質(zhì)點(diǎn)

圖1 腫瘤組(左)和SBPS組(右)蛋白表達(dá)圖譜

圖2 腫瘤組與SBPS組2－DE凝膠圖譜中的差異蛋白點(diǎn)

表2 腫瘤組與SBPS組特有的蛋白質(zhì)點(diǎn)

4 討論

多糖作為一種重要的天然大分子物質(zhì)，其抗腫瘤藥理作用已經(jīng)得到肯定［11－12］。半枝蓮多糖(Scutellaria barbata Polysaccharides，SBPS)是從半枝蓮中分離的主要有效成分之一。張秀娟等［13］研究表明，半枝蓮多糖在體內(nèi)對(duì)S180肉瘤的生長有一定的抑制作用，宋高臣等［14］研究發(fā)現(xiàn)，半枝蓮多糖能夠抑制小鼠HepA腫瘤生長，增加免疫器官重量。但半枝蓮多糖對(duì)肝癌的抑制作用機(jī)制鮮見報(bào)道，還有待進(jìn)一步研究。

雙向凝膠電泳技術(shù)作為蛋白質(zhì)組學(xué)研究的核心技術(shù)之一，廣泛應(yīng)用于尋找腫瘤發(fā)生發(fā)展相關(guān)蛋白的研究中。實(shí)驗(yàn)對(duì)比分析兩組血清蛋白的2－DE圖譜，腫瘤組與SBPS組蛋白表達(dá)發(fā)生了改變的有18個(gè)，在SBPS組有6個(gè)蛋白點(diǎn)表達(dá)上調(diào)，1個(gè)蛋白點(diǎn)表達(dá)下調(diào)，1個(gè)蛋白點(diǎn)在SBPS組特異表達(dá)，10個(gè)蛋白點(diǎn)在SBPS組表達(dá)缺失。這些蛋白可能是癌基因或抑癌基因產(chǎn)物，或者部分蛋白可能是潛在的癌基因或潛在的抑癌基因產(chǎn)物，SBPS通過上調(diào)抑癌基因的表達(dá)、下調(diào)癌基因的表達(dá)，進(jìn)而抑制腫瘤細(xì)胞的增殖或者誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。SBPS組特有的蛋白質(zhì)點(diǎn)所對(duì)應(yīng)的蛋白質(zhì)有可能是細(xì)胞出現(xiàn)的新的抑癌基因表達(dá)的產(chǎn)物，它們可能是SBPS作用的靶蛋白，由于SBPS的誘導(dǎo)表達(dá)發(fā)揮抗腫瘤增殖作用。

以上說明SBPS對(duì)肝癌的治療是通過多靶點(diǎn)調(diào)節(jié)共同作用的，其對(duì)肝癌的治療或許與改變這些蛋白質(zhì)點(diǎn)的表達(dá)相關(guān)。已發(fā)現(xiàn)的這些差異或特異表達(dá)的蛋白質(zhì)究竟是已知蛋白還是新蛋白，可通過質(zhì)譜鑒定、氨基酸的序列分析和數(shù)據(jù)庫檢索等方法，還需要進(jìn)一步確認(rèn)。

［1］ 國家藥典委員會(huì)．中華人民共和國藥典［S］．北京:化學(xué)工業(yè)出版社，2005:77－78．

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