鄧克紅，王晨陽，王武亮

鄭州大學第二附屬醫(yī)院婦產科 鄭州450014

#通訊作者，男，1963年11月生，本科，主任醫(yī)師，研究方向:婦科腫瘤，E-mail:wangwuliang888@sina.com

宮頸癌是女性最常見的惡性腫瘤之一。近20年來，發(fā)病率呈現(xiàn)年輕化特點。由于傳統(tǒng)手術和放療對患者生活質量的影響不可逆，所以宮頸癌化療受到了越來越多的關注［1］。表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)在很多實體瘤包括宮頸癌中都有過量表達［2］，與腫瘤細胞的惡性生物學特征和預后密切相關［3］。EGFR 抑制劑已成為靶向治療的熱點。西妥昔單抗(cetuximab，C225)是常見的特異性EGFR 抑制劑，臨床上已經用于晚期頭頸部鱗癌和直腸癌的治療，并取得了滿意的療效。奈達鉑(nedaplatin，NDP)屬第二代有機鉑類，其劑量限制毒性是血小板減少，部分患者因發(fā)生嚴重的血小板下降而導致化療停止［4］;臨床上已試圖尋找NDP 增敏藥物或聯(lián)合用藥以增強其療效，降低其毒副作用。有臨床研究［5］提出EGFR 特異性抑制劑C225 可增敏化療藥物的細胞殺傷作用，但C225與NDP 聯(lián)用的療效國內尚未見報道。該實驗旨在探討C225、NDP 單用及兩藥聯(lián)合應用對人宮頸癌Hela 細胞增殖作用的影響，為C225 在宮頸癌中的應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 細胞培養(yǎng)及主要試劑 Hela 細胞株(購自鄭州創(chuàng)生生物工程有限公司)用含體積分數(shù)10%胎牛血清的RPMI 1640 培養(yǎng)液在37℃、含體積分數(shù)5%CO2的培養(yǎng)箱培養(yǎng)，2.5 g/L 胰蛋白酶原消化傳代。C225 購自長沙市康來醫(yī)藥公司，NDP 購自江蘇奧賽康藥業(yè)有限公司。

1.2 C225 對Hela 細胞增殖的抑制作用 取對數(shù)生長期細胞制成單細胞懸液，細胞密度調至(4～5)×106mL－1。按每孔100 μL 接種在96 孔板上，置于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，細胞全部貼壁后，棄去孔內的培養(yǎng)液，依實驗分組加入100 μL 不同質量濃度(10、20、40、60、80 和160 mg/L)的C225 和100 μL RPMI 1640，總體積200 μL。每個質量濃度設5 個復孔(陰性對照為單細胞懸液)。繼續(xù)分別培養(yǎng)24、48 和72 h。在相應時間點每孔加入20 μL MTT 繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄去上清液后每孔加入200 μL二甲基亞砜(DMSO)，置于搖床上低速振蕩10 min。在自動酶標讀數(shù)儀上選擇波長490 nm，空白組調零，測各孔的OD 值，并計算細胞增殖抑制率。實驗重復5 次。計算公式為:細胞增殖抑制率=(1 －實驗組平均OD 值/對照平均OD 值)×100%。

1.3 NDP 對Hela 細胞增殖的抑制作用 按1.2的方法培養(yǎng)細胞，用不同質量濃度(1、5、10、20、40和60 mg/L)NDP 分別培養(yǎng)24、48 和72 h，用MTT法測細胞增殖抑制率。

1.4 40 mg/L C225 聯(lián)合不同質量濃度NDP 對Hela 細胞增殖的抑制作用 按1.2 的方法培養(yǎng)細胞。將C225 質量濃度定為40 mg/L，分別與奈達鉑(1、5、10、20、40 和60 mg/L)聯(lián)合處理細胞，設空白組、對照組，每組分別培養(yǎng)24、48 和72 h 后用MTT法測細胞增殖抑制率。

1.5 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 17.0 進行分析，應用6×3 析因設計的方差分析比較C225、NDP 單藥及聯(lián)合用藥不同質量濃度及不同時間對宮頸癌Hela細胞抑制作用的差異，檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 C225 單藥對宮頸癌Hela 細胞的增殖抑制作用 見表1。由表1可以看出，隨著C225 質量濃度的增加和作用時間的延長，細胞增殖抑制率的變化差異無統(tǒng)計學意義。

表1 C225 對宮頸癌Hela 細胞的增殖抑制率(n=5)%

2.2 NDP 單藥對宮頸癌Hela 細胞的增殖抑制作用 見表2。由表2可以看出，隨著NDP 質量濃度的增加和作用時間的延長，細胞的增殖抑制率逐漸增加。

表2 NDP 單藥對宮頸癌Hela 細胞的增殖抑制率(n=5)%

2.3 C225 聯(lián)合NDP 對宮頸癌Hela 細胞的增殖抑制作用 由于各質量濃度的C225 對Hela 細胞增殖抑制作用差異無統(tǒng)計學意義，故根據臨床經驗選擇質量濃度為40 mg/L C225 聯(lián)合不同質量濃度NDP作用于Hela 細胞，24、48 和72 h 后的細胞增殖抑制率見表3。從表3可以看出，C225 聯(lián)合NDP 用藥對細胞增殖的抑制率明顯高于對應的C225 或NDP單藥。

表3 40 mg/L C225 聯(lián)合不同質量濃度NDP 對宮頸癌Hela 細胞的增殖抑制率(n=5)%

3 討論

EGFR 廣泛地存在于正常人體的細胞表面，配體與其結合后調控細胞的生理過程，在正常細胞的生長、增殖、分化及凋亡過程中發(fā)揮著重要的功能。EGFR 基因的突變和EGFR 的異常高表達可以在多種實體惡性腫瘤中檢測到［2］，如宮頸癌、卵巢癌、直腸癌、非小細胞肺癌、神經膠質瘤等。EGFR 蛋白的異常高表達促使腫瘤細胞活化，長期處于無限增殖狀態(tài)，是腫瘤形成的重要原因之一［6］。有研究者［4］提出，EGFR 在宮頸癌中陽性表達者占60%～90%，且EGFR 的高表達與宮頸癌的復發(fā)及預后密切相關。并且EGFR 蛋白的異常高表達可增加腫瘤細胞粘附于細胞外基質，增加腫瘤細胞降解基底膜、血管形成及遠處轉移的機會［7］。特異性的EGFR 靶向藥物目前主要有兩種:一種是小分子酪氨酸激酶(EGFR-TK)抑制劑，可促進凋亡［8］，代表藥物是易瑞沙;另一種是單克隆抗體，主要作用于EGFR 位于細胞外的配體結合區(qū)，競爭性地抑制受體與配體的結合，阻斷受體激活途徑，代表藥物是C225。臨床上，C225 已經用于某些腫瘤如直腸癌、頭頸部腫瘤等的治療，并且取得了較好的療效。但關于C225 對宮頸癌的療效，國內外研究較少。作者通過體外實驗研究顯示C225 單藥對宮頸癌Hela 細胞增殖無明顯抑制作用?？赡茉蚴荂225 的主要抗癌機制并不是直接作用于腫瘤細胞，由于腫瘤組織內細胞與細胞間存在復雜的細胞應答反應，體外細胞培養(yǎng)缺少細胞間的相互作用和影響，C225 可能通過直接或間接影響腫瘤細胞血管生成、細胞粘附及增殖能力而發(fā)揮抗腫瘤作用。

臨床上，NDP 對宮頸癌、頭頸癌、非小細胞肺癌、食管癌、卵巢癌等多種惡性腫瘤有效。NDP 與順鉑相比，胃腸道反應輕，腎毒性和神經毒性小，患者的總生存率與順鉑相同，但有提高趨勢［4］。Koshiyama 等［9］提出，在臨床前研究中，與順鉑的抗腫瘤活性相比，NDP 更好。但NDP 的劑量限制毒性是骨髓抑制導致的血小板減少，部分患者發(fā)生嚴重的血小板下降導致化療停止［4］。該實驗研究顯示，NDP 對Hela 的增殖抑制作用呈現(xiàn)明顯的質量濃度和時間依賴，與文獻［10］報道基本一致。

有研究報道靶向藥物和化療藥物因不同的抗腫瘤作用機制，故沒有重復交叉細胞毒作用，還可在增加彼此療效的同時降低各自用藥劑量，并降低了對正常細胞的毒副作用。研究［11］表明，C225 與化療藥物聯(lián)合應用療效要優(yōu)于單純化療。該研究結果顯示C225 聯(lián)合NDP 后，細胞增殖抑制率明顯增加，明顯高于C225 單藥或NDP 單藥，且呈現(xiàn)質量濃度和時間依賴，說明C225 能增敏Hela 細胞對NDP 的反應。當NDP 的質量濃度較低時，C225 增敏作用較明顯，隨著NDP 質量濃度逐漸增加，聯(lián)合用藥時細胞增殖抑制率增幅較濃度低時減弱。該研究屬體外實驗，還缺乏生物體內復制的細胞與細胞間反應和調節(jié)機制的研究，需要體內試驗進一步深入探索。

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