唐 悅，軒小燕，柳璐璐，李 敏

鄭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院微生物學(xué)與免疫學(xué)教研室 鄭州450001

#通訊作者，女，1975年1月生，博士，副教授，研究方向:食管癌防治，E-mail:liminzzu@gmail.com

食管癌是發(fā)生在食管上皮組織的惡性腫瘤，占所有惡性腫瘤的2%。化療是腫瘤患者(包括術(shù)后患者)的主要治療手段之一。化療耐藥尤其是對(duì)最常用的鉑類化療藥物的耐藥限制了化療藥物的治療效果，也是引起腫瘤化療失敗及復(fù)發(fā)的主要原因［1-2］，因此逆轉(zhuǎn)化療耐藥的研究成為所有問(wèn)題的焦點(diǎn)。谷胱甘肽S 轉(zhuǎn)移酶(glutathione S-transferase，GST)是一組具有復(fù)雜生理功能的蛋白質(zhì)，主要參與機(jī)體的解毒［3］。近年來(lái)其亞型GST-π 成為腫瘤化療耐藥研究的新熱點(diǎn)［4-6］。作者前期的研究［7-8］表明人食管鱗狀細(xì)胞癌順鉑耐藥細(xì)胞系EC9706/cDDP 細(xì)胞中GST-π 的表達(dá)明顯增加，說(shuō)明GST-π 與食管癌細(xì)胞的順鉑耐藥性有一定關(guān)系。為進(jìn)一步研究GST-π 基 因 在 多 藥 耐 藥(multidrug resistence，MDR)形成中的作用及探索有效的MDR 逆轉(zhuǎn)方法，作者構(gòu)建了靶向GST-π 基因的siRNA 重組慢病毒，轉(zhuǎn)染EC9706/cDDP 細(xì)胞，觀察細(xì)胞對(duì)化療藥物敏感性的改變，探討沉默GST-π 的表達(dá)是否會(huì)在一定程度上逆轉(zhuǎn)EC9706/cDDP 的順鉑耐藥性。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞與主要試劑 高分化EC9706/cDDP 細(xì)胞由鄭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院李敏老師的研究團(tuán)隊(duì)保存。EC9706、慢病毒包裝細(xì)胞293FT、大腸桿菌DH5α 和pRNAT-U6.2/Lenti 表達(dá)載體為鄭州大學(xué)微生物學(xué)與免疫學(xué)教研室保存。RPMI 1640 培養(yǎng)液購(gòu)自美國(guó)Gibco 公司。ViraPowerTM慢病毒包裝混合物(經(jīng)優(yōu)化的包含3 種包裝質(zhì)粒的混合物)、轉(zhuǎn)染試劑LipofectamineTM2000 購(gòu)自美國(guó)Invitrogen 公司。膠回收試劑盒及小量質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)自Axygen 公司。兔抗人GST-π 抗體、羊抗兔多克隆抗體及TRITC 標(biāo)記的羊抗兔抗體購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。編碼發(fā)卡樣RNA 的寡核苷酸及相關(guān)引物均由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

1.2 siRNA 的設(shè)計(jì)與合成根據(jù) GenBank BT019950 GST-π mRNA 序列，應(yīng)用Ambion siRNA靶序列分析設(shè)計(jì)系統(tǒng)，針對(duì)靶基因序列設(shè)計(jì)多個(gè)RNA 干擾(RNAi)靶點(diǎn)序列，最終確定2 個(gè)長(zhǎng)為19 bp 的靶序列:5'-GACCTCCGCTGCAAATACA-3'(295～313 位點(diǎn))、5'-GAGGCAAGACCTTCATTGT-3'(416～434 位點(diǎn))。設(shè)計(jì)分別針對(duì)這2 個(gè)靶序列的2對(duì)編碼短發(fā)卡RNA 的寡核苷酸序列(第一對(duì)為GST11、GST12;第二對(duì)為GST21、GST22)，同時(shí)依據(jù)這2 個(gè)靶位點(diǎn)的堿基組成，隨機(jī)組合出一條無(wú)關(guān)對(duì)照寡核苷酸序列5'-TACGCTGACTTGATTGTTC-3'，針對(duì)該序列的編碼短發(fā)卡RNA 的寡核苷酸序列為GSTC1、GSTC2。

1.3 siRNA 慢病毒表達(dá)載體的制備與鑒定 用BamHⅠ/XhoⅠ雙酶切pRNAT-U6.2/Lenti 載體，與設(shè)計(jì)合成的GST-π siRNA 模板寡核苷酸膠回收產(chǎn)物連接后轉(zhuǎn)化到DH5α 感受態(tài)細(xì)菌中，陽(yáng)性克隆送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測(cè)序。成功得到3 種siRNA 慢病毒表達(dá)載體:pRNAT-U6.2/LentisiGST1、pRNAT-U6.2/Lenti-siGST2、pRNAT-U6.2/Lenti-siGSTC。

1.4 慢病毒包裝 將ViraPowerTM慢病毒包裝混合物和siRNA 慢病毒表達(dá)載體(pRNAT-U 6.2/LentisiGST1、pRNAT-U6.2/Lenti-siGST2 或pRNAT-U6.2/Lenti-siGSTC)轉(zhuǎn)染至293FT 細(xì)胞，置CO2培養(yǎng)箱，37℃孵育過(guò)夜后更換為含1 mol/L 丙酮酸鈉的完全培養(yǎng)基培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染48～72 h 后將含病毒的上清液移至15 mL 無(wú)菌錐形管，4℃3 000 r/min 離心5 min，除去細(xì)胞碎片。210 000 g 離心90 min，棄上清，450 μL PBS 重懸。3 種病毒分別命名為GSTsi1、GSTsi2 和GSTsiC。吸取病毒懸液至冷凍管分裝，－80℃保存。

1.5 病毒滴度測(cè)定 將293FT 細(xì)胞按2×105個(gè)/孔接種至6 孔板中，24 h 后取病毒GSTsi1、GSTsi2和GSTsiC 懸液作不同比例稀釋(1 ∶103～1∶1010)，按每孔400 μL 加至細(xì)胞培養(yǎng)板中，37℃培養(yǎng)4～6 h。換新鮮培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，熒光顯微鏡下觀察，病毒滴度參照文獻(xiàn)［9］的方法計(jì)算。

1.6 免疫熒光實(shí)驗(yàn) EC9706/cDDP 細(xì)胞接種24 h后，按細(xì)胞與病毒數(shù)1∶10 的比例加入GSTsi2 病毒稀釋液，將細(xì)胞用40 g/L 多聚甲醛固定、體積分?jǐn)?shù)為20%正常山羊血清封閉后，加一抗(兔抗人GSTπ 抗體)4℃孵育過(guò)夜，PBS 沖洗3 次后加二抗(TRITC 標(biāo)記的羊抗兔抗體)。暗環(huán)境37℃條件下孵育2 h，沖洗后用水溶性封片劑封片。

1.7 GST-π mRNA 和蛋白表達(dá)的檢測(cè) 分別用相關(guān)基因引物進(jìn)行半定量RT-PCR，以β-actin 作內(nèi)參。PCR 反應(yīng)體系含:10× Buffer 3.0 μL，Taq 酶0.15 μL，dNTP 2.4 μL，上、下游引物各1.0 μL，模板2.0 μL。PCR 反應(yīng)條件:94℃5 min 預(yù)變性;94℃變性45 s，55℃退火45 s，72℃延伸60 s，35 個(gè)循環(huán);72℃延伸5 min。GST-π mRNA 的相對(duì)表達(dá)量以目的基因與內(nèi)參條帶灰度值的比值表示。Western blot法檢測(cè)GST-π 蛋白的表達(dá)。取50 μg 蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE 電泳，電泳后利用電印記法將凝膠中的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到PVDF 膜上。將含50 g/L 脫脂奶粉且TBS 封閉后的PVDF 膜置于封閉液稀釋的兔抗人GST-π 一抗中，室溫?fù)u床振蕩1 h，取出漂洗;再加入用封閉液稀釋的羊抗兔多克隆抗體中，室溫?fù)u床振蕩1 h，取出漂洗。用ECL 試劑化學(xué)發(fā)光、顯影。

1.8 MTT 法檢測(cè)細(xì)胞對(duì)順鉑耐藥敏感性的變化取GSTsi2、GSTsiC 感染和未感染的EC9706/cDDP對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，以3×104mL－1細(xì)胞濃度接種于96 孔培養(yǎng)板，200 μL/孔。24 h 后更換含不同終濃度順鉑的培養(yǎng)液，每一濃度重復(fù)4 孔，并設(shè)不含藥的空白對(duì)照孔。48 h 后加入5 g/L MTT 20 μL/孔，繼續(xù)培養(yǎng)4 h 后，加入二甲基亞砜(DMSO)200 μL/孔，充分混勻，以波長(zhǎng)550 nm 測(cè)各孔吸光度(A)值。同時(shí)檢測(cè)親本EC9706 細(xì)胞。增殖抑制率=(1 －加藥孔A 值/對(duì)照孔A 值)×100%。計(jì)算IC50。耐藥指數(shù)(RI)=實(shí)驗(yàn)細(xì)胞IC50/親本細(xì)胞IC50。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 17.0 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理分析。各組細(xì)胞GST-π mRNA 表達(dá)和RI 差異的比較采用單因素方差分析及SNK-q 檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 siRNA 慢病毒表達(dá)載體的鑒定結(jié)果 重組質(zhì)粒的PCR 鑒定結(jié)果見(jiàn)圖1。陽(yáng)性克隆測(cè)序結(jié)果與設(shè)計(jì)序列完全一致。

圖1 重組質(zhì)粒的PCR 鑒定結(jié)果

2.2 病毒滴度的測(cè)定結(jié)果 經(jīng)測(cè)定，GSTsi1、GSTsi2 和GSTsiC 的病毒滴度均可用于后續(xù)的細(xì)胞感染。病毒感染EC9706/cDDP 細(xì)胞48 h 后在熒光顯微鏡下可見(jiàn)綠色熒光蛋白的表達(dá)，隨時(shí)間的延長(zhǎng)表達(dá)增強(qiáng)。細(xì)胞的感染率較高，幾乎所有細(xì)胞均被感染。慢病毒感染過(guò)的細(xì)胞上清液收集后用于新的EC9706/cDDP 細(xì)胞培養(yǎng)，48 h 后未見(jiàn)有熒光，表明慢病毒感染細(xì)胞后的上清沒(méi)有感染性，安全性較高。

2.3 各組細(xì)胞中GST-π mRNA 和蛋白表達(dá)的比較 見(jiàn)表1、圖2。

表1 各組細(xì)胞中GST-π mRNA 的表達(dá)(n=4)

圖2 各組細(xì)胞中GST-π蛋白的表達(dá)

2.4 各組細(xì)胞對(duì)順鉑耐藥敏感性的變化 見(jiàn)表2。

表2 各組細(xì)胞的RI 比較(n=4)

2.5 免疫熒光實(shí)驗(yàn)結(jié)果 免疫熒光實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖3。GSTsi2 干擾后在熒光顯微鏡下發(fā)紅色熒光的EC9706/cDPP 細(xì)胞數(shù)目少且熒光很弱，表明GSTsi2可有效抑制細(xì)胞內(nèi)GST-π 基因的表達(dá)。

圖3 免疫熒光實(shí)驗(yàn)結(jié)果(×100)

3 討論

GST 廣泛分布于人的正常組織，與惡性腫瘤的關(guān)系密切，是腫瘤細(xì)胞耐藥的標(biāo)志之一。Tew 等［9］對(duì)于腫瘤細(xì)胞株的研究發(fā)現(xiàn)，GST-π 參與了細(xì)胞對(duì)順鉑、阿霉素以及絲裂霉素C 耐藥的產(chǎn)生。張帆等［10］發(fā)現(xiàn)術(shù)前未經(jīng)治療的卵巢癌在一定程度上存在著由GST-π 介導(dǎo)的內(nèi)在性的耐藥機(jī)制，GST-π 的表達(dá)能較好地預(yù)測(cè)化療反應(yīng)。

近年來(lái)對(duì)MDR 逆轉(zhuǎn)的研究有較大進(jìn)展。隨著科研人員對(duì)GST 的結(jié)構(gòu)和生物學(xué)功能的深入研究，一些以GST 為靶點(diǎn)的腫瘤MDR 逆轉(zhuǎn)劑被發(fā)現(xiàn)。Yu等［11］的研究表明色胺酮可以抑制MCF-7 細(xì)胞株的GST 活性并且降低GST-π 的表達(dá)。在已有的逆轉(zhuǎn)MDR 的反義基因治療技術(shù)中，常用的是反義寡核苷酸和核酶，它們特異性地作用于MDR 基因，使其轉(zhuǎn)錄和翻譯過(guò)程受阻，從而達(dá)到逆轉(zhuǎn)MDR 的目的。Ban 等［12］發(fā)現(xiàn)針對(duì)GST-π 基因的反義cDNA 轉(zhuǎn)染能夠引起腫瘤細(xì)胞對(duì)包括順鉑、阿霉素在內(nèi)的多種抗腫瘤藥物的敏感性增強(qiáng)。RNAi 是dsRNA 介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄后基因沉默，具有高效性、高度特異性和可遺傳性，是一種新興的基因治療技術(shù)。以特異性短發(fā)卡RNA 介導(dǎo)的RNAi 技術(shù)為逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞MDR 的治療開(kāi)創(chuàng)了新的思路［13-16］。應(yīng)用siRNA 克服食管癌治療中對(duì)順鉑的耐藥，不僅將提高腫瘤的化療效果，減少化療藥物的用量，降低化療藥物的毒副作用，而且對(duì)克服其他腫瘤中的MDR 現(xiàn)象也有借鑒意義。

課題組前期研究提示 GST-π 很可能在EC9706/cDDP MDR 的形成中起一定作用(待發(fā)表)。為了明確GST-π 基因沉默是否會(huì)在一定程度上逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞的耐藥性，該實(shí)驗(yàn)用靶向GST-π 的siRNA 重組慢病毒GSTsi1、GSTsi2 感染EC9706/cDDP。結(jié)果顯示RNAi 策略可下調(diào)EC9706/cDDP 細(xì)胞GST-π mRNA 的相對(duì)表達(dá)水平，GST-π 蛋白表達(dá)也減弱。作者選擇干擾能力更強(qiáng)的GSTsi2 感染EC9706/cDDP 細(xì)胞，結(jié)果顯示該細(xì)胞對(duì)順鉑的RI下降。以上結(jié)果表明GST-π 的表達(dá)與腫瘤細(xì)胞的耐藥性相關(guān)，RNAi 技術(shù)可逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞的耐藥性，這為應(yīng)用siRNA 逆轉(zhuǎn)腫瘤耐藥提供了可行依據(jù)，并為尋找有效的食管癌臨床化療方案提供了參考。

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