李東霞，王雁萍，李宗偉，袁世超，楊慧曉，金慶生

1(鄭州大學(xué)離子束生物工程省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南鄭州，450052)2(浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物與核技術(shù)利用研究所，浙江杭州，310021)

單增李斯特氏菌是一種威脅人畜健康的重要病原菌;該菌在自然界分布廣泛，在土壤、污水、糞便、動(dòng)物飼料中均有存在，且動(dòng)物很容易攝入該菌，并且通過(guò)攝入和排泄的途徑到處傳播［1］。近年來(lái)，在某些食品如乳制品，肉制品以及即食用型蔬菜中該菌檢出率很高，因食品污染李斯特氏菌而引起的食物中毒，腦膜炎及敗血癥病例也頻繁發(fā)生。采取有效的措施控制單增李斯特氏菌在食品中的污染，消除其對(duì)食品安全及人類(lèi)健康造成的威脅已經(jīng)引起世界各國(guó)的重視［2-3］。

近年來(lái)，一些學(xué)者發(fā)現(xiàn)應(yīng)用食品級(jí)乳酸菌產(chǎn)生的細(xì)菌素是抑制單增李斯特氏菌的一種有效方法［4］。乳酸菌(lactic acid bacteria，LAB)是發(fā)酵糖類(lèi)主要產(chǎn)物為乳酸的革蘭氏染色陽(yáng)性細(xì)菌，其具有拮抗腸道內(nèi)病原菌的作用，可通過(guò)產(chǎn)生有機(jī)酸、過(guò)氧化氫和細(xì)菌素等多種代謝產(chǎn)物，抑制食品中的腐敗菌和病原菌;現(xiàn)已被廣泛應(yīng)用于食品加工、醫(yī)藥保健、飼料發(fā)酵及畜禽疾病防治等方面。乳酸菌細(xì)菌素(Bacteriocins of LAB)是指乳酸菌在代謝過(guò)程中通過(guò)核糖體合成的對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌有抑制作用的多肽或蛋白質(zhì)類(lèi)物質(zhì)。由于食品病原菌和濫用抗生素危害的加劇，人們開(kāi)始尋找天然安全的食品添加劑，細(xì)菌素以其無(wú)毒性、易被消化道內(nèi)酶降解等特性，被公認(rèn)為具有應(yīng)用于食品和飼料中殺菌防腐的潛力［5-6］。

我國(guó)乳酸菌資源豐富，如何有效地開(kāi)發(fā)利用現(xiàn)有的乳酸菌資源尤為重要?，F(xiàn)在，一些學(xué)者開(kāi)始重視研究來(lái)自傳統(tǒng)食品中的優(yōu)良乳酸菌菌株［7］。發(fā)酵面食是我國(guó)傳統(tǒng)食品之一，我國(guó)傳統(tǒng)發(fā)酵面食采用的“面引子”由于其自然發(fā)酵產(chǎn)生的多種芳香物質(zhì)能夠賦予面食特殊的風(fēng)味，也是發(fā)酵面食所用菌種的主要來(lái)源。在不同地區(qū)的發(fā)酵面團(tuán)中，真菌主要以酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)為主，細(xì)菌主要以乳酸菌(lactic acid bacteria)為主［8-9］;但是目前關(guān)于發(fā)酵面團(tuán)來(lái)源的乳酸菌及其抑菌活性的研究較少。

本研究以普通發(fā)酵面團(tuán)為乳酸菌分離源，并從中篩選到一株對(duì)單增李斯特氏菌有較強(qiáng)抑制作用的乳酸菌，經(jīng)鑒定該菌為L(zhǎng)actobacillus curvatus，為其在食品和飼料中進(jìn)一步深入研究和應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)菌株

乳酸菌菌株共54株，分離自河南開(kāi)封，商丘，天津，黑龍江大興安嶺呼瑪縣四地區(qū)家庭普通發(fā)酵面團(tuán)樣品，根據(jù)形態(tài)學(xué)特征初定為乳酸菌;指示菌為單增李斯特氏菌(Listeria monocytogenes，ATCC BAA-751)，保存于本實(shí)驗(yàn)室。

1.2 試劑及培養(yǎng)基

過(guò)氧化氫酶，胰蛋白酶，蛋白酶K，菌株DNA提取試劑盒，MRS培養(yǎng)基，NA培養(yǎng)基。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 抗單增李斯特氏菌乳酸菌的初篩

將保存于-80℃冰箱中的54株乳酸菌活化后，接種到MRS液體培養(yǎng)基，30℃培養(yǎng)24 h。制備乳酸菌無(wú)細(xì)胞發(fā)酵上清液，制備指示菌菌懸液，采用牛津杯雙層平板法進(jìn)行抑菌試驗(yàn)［10］。

2.2 產(chǎn)抗單增李斯特氏菌細(xì)菌素乳酸菌的復(fù)篩

2．2．1 酸作用的排除

挑取對(duì)單增李斯特氏菌有抑制作用的菌株，制備無(wú)細(xì)胞發(fā)酵上清液，測(cè)上清液的pH值，用2 mol/L NaOH調(diào)發(fā)酵上清液pH值至7．0，用牛津杯雙層平板法做抑菌試驗(yàn)。

2．2．2 過(guò)氧化氫酶作用的排除

將酸排出后依然有抑菌作用的乳酸菌菌株無(wú)細(xì)胞發(fā)酵上清液pH調(diào)至7．0，按照過(guò)氧化氫酶終濃度為1．0 mg/mL加入到發(fā)酵液中，37℃水浴2h，檢測(cè)其抑菌活性。

2．2．3 蛋白酶解檢測(cè)

挑取篩選出的乳酸菌制備無(wú)細(xì)胞發(fā)酵上清液，調(diào)發(fā)酵上清液pH至7．0，按100μg/mL加入胰蛋白酶和蛋白酶K，同上處理。

2.3 乳酸菌細(xì)菌素初步分析

2．3．1 熱敏感性

將篩選出的菌株無(wú)細(xì)胞發(fā)酵上清液pH調(diào)至7．0后分別置60℃，80℃，100℃水浴鍋30 min和60 min，121℃滅菌鍋15 min;冷卻后進(jìn)行抑菌實(shí)驗(yàn)。

2．3．2 pH 敏感性

用2 mol/L HCL和2 mol/L NaOH調(diào)無(wú)細(xì)胞發(fā)酵上清液 pH 值分別為 2．0、3．0、4．0、5．0、6．0、7．0、8．0、9．0，37 ℃溫育2 h 后，進(jìn)行抑菌試驗(yàn)。

2．3．3 共培養(yǎng)性質(zhì)

將乳酸菌上清液和單核增生李斯特菌進(jìn)行試管混合共同培養(yǎng)，在NA液體培養(yǎng)基內(nèi)按照5∶2的體積比例接入乳酸菌無(wú)細(xì)胞發(fā)酵上清液，再加入100μl培養(yǎng)24h的單增李斯特氏菌菌液;每4 h取樣，測(cè)定600 nm條件下的光密度值;以NA液體培養(yǎng)基接入MRS液體培養(yǎng)基，再加入同上單增李斯特氏菌菌液為對(duì)照。以共培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)，光密度值為縱坐標(biāo)，繪制乳酸菌上清液與單核增生李斯特菌共培養(yǎng)的曲線圖。

2．3．3 細(xì)菌素分子量的測(cè)定

乳酸菌菌株無(wú)細(xì)胞發(fā)酵上清液經(jīng)70%飽和度硫酸銨鹽析、透析及超濾濃縮處理，將依然保留較強(qiáng)抑菌活性的純化液采用Tricine-SDS-PAGE［11］方法測(cè)定細(xì)菌素分子量。

2.4 產(chǎn)細(xì)菌素乳酸菌的鑒定

根據(jù)乳酸菌生理生化特性以及16S rDNA的遺傳學(xué)鑒定［12］。

3 結(jié)果

3.1 初篩結(jié)果

對(duì)實(shí)驗(yàn)室保存的從發(fā)酵面團(tuán)中分離出的54株乳酸菌進(jìn)行抑菌試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)有43株對(duì)單增李斯特氏菌有較強(qiáng)的抑制作用。挑選這43株菌進(jìn)一步篩選產(chǎn)抗單增李斯特氏菌細(xì)菌素的乳酸菌。

3.2 復(fù)篩結(jié)果

43株乳酸菌中只有編號(hào)為ZZU M5-2的菌株在酸排除及過(guò)氧化氫排除后仍然有抑菌活性。如表1及圖1所示，在pH調(diào)至7．0后，菌株ZZU M5-2的上清液與原液相比抑菌作用有所減弱，但依然保留非常明顯的抑菌活性;由此推測(cè)其發(fā)酵上清液中存在除有機(jī)酸以外的其他抑菌活性物質(zhì)。乳酸菌在生長(zhǎng)代謝過(guò)程中可能產(chǎn)生過(guò)氧化氫抑制其他細(xì)菌的生長(zhǎng)，因此實(shí)驗(yàn)將ZZU M5-2菌株發(fā)酵上清液pH調(diào)至7．0后加過(guò)氧化氫酶處理，結(jié)果顯示其抑菌圈直徑較酸排除處理的差別不大，這說(shuō)明該菌株發(fā)酵上清液主要抑菌活性物質(zhì)不是過(guò)氧化氫。

表1 ZZU M5-2的抑菌效果Table 1 Antimicrobial activity of ZZU M5-2

將菌株ZZU M5-2的發(fā)酵上清液進(jìn)行胰蛋白酶和蛋白酶K的酶解實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)在加入胰蛋白酶或蛋白酶K后其抑菌活性完全消失，如圖1所示，說(shuō)明菌株ZZU M5-2發(fā)酵上清液中存在的主要抑菌活性物質(zhì)是蛋白類(lèi)物質(zhì)，是一類(lèi)細(xì)菌素。

圖1 ZZU M5-2的抑菌效果Fig．1 Antimicrobial activity of ZZU M5-2

3.3 細(xì)菌素初步分析

3．3．1 細(xì)菌素對(duì)熱的穩(wěn)定性

將pH值調(diào)至7．0的乳酸菌無(wú)細(xì)胞發(fā)酵上清液分別在60、80、100 ℃處理30和60 min，121 ℃15 min后做抑菌試驗(yàn)，結(jié)果如表1所示，其在60和80℃熱處理后抑菌活性基本保持不變，表現(xiàn)出良好的熱穩(wěn)定性，且加熱時(shí)間對(duì)其影響不大;但隨著溫度的繼續(xù)升高，加熱時(shí)間延長(zhǎng)，其抑菌活性逐漸降低，甚至在121℃時(shí)完全消失。

3．3．2 細(xì)菌素對(duì)pH的穩(wěn)定性

從表1可以看出，菌株M5-2產(chǎn)生的細(xì)菌素在pH 2．0～8．0范圍內(nèi)，對(duì)單增李斯特氏菌有抑制作用;且其抑菌活性隨著pH值的減小而增大，當(dāng)pH 9．0時(shí)，抑菌活性消失。這說(shuō)明該菌株產(chǎn)生的細(xì)菌素在酸性及中性環(huán)境中可以很好地發(fā)揮抑菌作用。

3．3．3 共培養(yǎng)性質(zhì)

由圖2可知，在培養(yǎng)8h之前加入ZZU M5-2發(fā)酵上清液與對(duì)照相同對(duì)單增李斯特氏菌的生長(zhǎng)沒(méi)有明顯影響，在8h后可以看出2種處理的單增李斯特氏菌都進(jìn)入了對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，但是加入ZZU M5-2發(fā)酵上清液的處理與對(duì)照相比生長(zhǎng)緩慢，且隨著時(shí)間的延長(zhǎng)這種趨勢(shì)越來(lái)越明顯，并在24h時(shí)比對(duì)照提前進(jìn)入穩(wěn)定期;這進(jìn)一步說(shuō)明ZZU M5-2發(fā)酵上清液中抑菌物質(zhì)可以明顯抑制單增李斯特氏菌的生長(zhǎng)。

圖2 ZZU M5-2發(fā)酵上清液對(duì)單核細(xì)胞增生李斯特菌的抑制作用Fig．2 The inhibition of ZZU M5-2 towards L．monocytogenes

3．3．4 細(xì)菌素分子質(zhì)量的測(cè)定

將分離純化的細(xì)菌素樣品經(jīng)過(guò)Tricine-SDSPAGE電泳分析，所得電泳圖譜見(jiàn)圖3，ZZUM5-2產(chǎn)生的細(xì)菌素分子質(zhì)量約為25 kDa。

圖3 ZZU M5-2產(chǎn)細(xì)菌素的電泳圖譜Fig．3 Tricine-SDS-PAGE of bacteriocin produced by ZZU M5-2

3.4 產(chǎn)細(xì)菌素乳酸菌的鑒定

3．4．1 菌落形態(tài)

菌落呈圓形，半透明，表面光滑，邊緣整齊。

3．4．2 菌株的形態(tài)及生理生化特性

由表2可以看出菌株ZZU M5-2可以耐受10℃低溫，而在45、50℃高溫及5℃低溫條件下生長(zhǎng)能力微弱;在 pH 4．0～9．0可以生長(zhǎng)良好;可以耐受 3．5%的鹽濃度。

表2 菌株形態(tài)及生理生化特性鑒定結(jié)果Table 2 The results of strain shape and microbiological identification

3．4．3 16S rDNA 序列分析

將測(cè)得的16S rDNA序列與通過(guò)Blast在Gen-Bank中檢測(cè)得到的標(biāo)準(zhǔn)菌株序列信息用CLUSTAL W軟件比對(duì)。采用鄰接法構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)(neighbor-joining method)如圖3所示，枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis被用作外圍菌株。

結(jié)合生理生化試驗(yàn)及16S rDNA序列結(jié)果分析，ZZU M5-2被鑒定為L(zhǎng)actobacilluscurvatus．

圖3 ZZU M5-2的16S rDNA序列系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig．3 Phylogenetic tree of strain ZZU M5-2 based on 16S rDNA sequence

4 討論

實(shí)驗(yàn)從發(fā)酵面團(tuán)來(lái)源的乳酸菌中篩選到1株對(duì)單增李斯特氏菌有較強(qiáng)抑制作用的菌株ZZU M5-2，該菌株無(wú)細(xì)胞發(fā)酵上清液在經(jīng)過(guò)酸排除及過(guò)氧化氫排除后依然有很強(qiáng)的抑菌活性，但這種抑菌活性在蛋白酶處理后消失，這與前人報(bào)道的細(xì)菌素情況一致［13］，因此推斷該菌株產(chǎn)生的能夠抑菌活性物質(zhì)主要為細(xì)菌素。

乳酸菌種類(lèi)繁多，不同的菌株產(chǎn)生的細(xì)菌素性質(zhì)也不盡相同，S．Oh等人的實(shí)驗(yàn)菌株Lactobacillus acidophilus 30SC所產(chǎn)生的細(xì)菌素在121℃處理20 min仍然保持50%的抑菌活性［14］，Yurong Gao等人從中國(guó)傳統(tǒng)發(fā)酵蔬菜中分離到的Lactobacillussake C2產(chǎn)生的細(xì)菌素sakacin C2在121℃處理20 min后仍然對(duì)Staphylococcus aureus ATCC 63589有80．9%的抑菌活性;本實(shí)驗(yàn)篩選到的ZZU M5-2產(chǎn)生的細(xì)菌素在60和80℃熱處理后能保持穩(wěn)定的抑菌活性，但在100℃時(shí)活性明顯下降，并在121℃活性完全消失;推測(cè)原因可能是本實(shí)驗(yàn)篩選出的乳酸菌所產(chǎn)細(xì)菌素是蛋白質(zhì)類(lèi)細(xì)菌素，對(duì)熱敏感，在高溫條件下空間結(jié)構(gòu)容易發(fā)生變化，從而失活導(dǎo)致抑菌活性降低;這類(lèi)細(xì)菌素物質(zhì)其分子質(zhì)量較大(＞10kDa)［15］，在食品生產(chǎn)中常用的巴斯德滅菌溫度為62～65℃，時(shí)間為30 min，這對(duì)菌株ZZU M5-2產(chǎn)生的細(xì)菌素保持良好的抑菌活性沒(méi)有影響，因此其在食品加工中有良好的應(yīng)用前景。

XIE等人從馬奶酒中分離到Lactobacillus plantarum LB-B1所產(chǎn)的細(xì)菌素在pH 2．0～8．0對(duì)Listeria monocytogenes保持穩(wěn)定的抑菌活性，在pH為10．0時(shí)抑菌活性略有下降［16］。與之相似，本實(shí)驗(yàn)篩選到的ZZU M5-2產(chǎn)生的細(xì)菌素在pH 2．0～8．0范圍內(nèi)均有明顯的抑菌活性，但在pH 9．0時(shí)抑菌活性消失;其抑菌活性隨著pH值的減小而增強(qiáng)，且在pH 2．0時(shí)抑菌活性最大，這可能是因?yàn)檫^(guò)酸的原因，研究表明，單增李斯特氏菌不能在此pH下生長(zhǎng)［2］。

將ZZU M5-2發(fā)酵上清液與單增李斯特氏菌共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步表明ZZU M5-2菌株發(fā)酵上清液中存在能抑制單增李斯特氏菌生長(zhǎng)的活性物質(zhì)，這與寧佳的實(shí)驗(yàn)結(jié)果類(lèi)似［2］，其在單增李斯特氏菌的對(duì)數(shù)早期加入乳酸片球菌P9發(fā)酵液雖然不能完全殺死指示菌，但可以明顯抑制生長(zhǎng)。

本實(shí)驗(yàn)測(cè)定出菌株ZZU M5-2所產(chǎn)細(xì)菌素分子量為25kDa，與前面推測(cè)結(jié)果相一致，進(jìn)一步證實(shí)其細(xì)菌素類(lèi)型為大分子蛋白質(zhì)類(lèi)細(xì)菌素。

在不同地區(qū)的發(fā)酵面團(tuán)中，細(xì)菌的組成差別較大。其中河南地區(qū)以Lactobacillus為優(yōu)勢(shì)菌，所占比例達(dá)40．704%［9］，與之相一致，本實(shí)驗(yàn)從開(kāi)封地區(qū)發(fā)酵面團(tuán)樣品中分離出的產(chǎn)細(xì)菌素菌株ZZU M5-2鑒定為L(zhǎng)actobacillus curvatus，其所產(chǎn)細(xì)菌素的分離純化及作用機(jī)理等有待進(jìn)一步研究。

［1］何浩，吳永生，于霞．產(chǎn)單核細(xì)胞增生性李斯特氏菌研究現(xiàn)狀［J］．肉品衛(wèi)生，2003(7):9-16．

［2］寧佳．具有抑制單核細(xì)胞增生李斯特菌的乳酸菌的篩選及抑菌性質(zhì)的研究［D］．無(wú)錫:江南大學(xué)，2012:18-21．

［3］于豐宇．食品中單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的毒力研究［D］．重慶:重慶大學(xué)，2011:11．

［4］Hartmann H A，Wilke T，Erdmann R．Efficacy of bacteriocin-containing cell-free culture supernatants from lactic acid bacteria to control Listeria monocytogenes in food［J］．International Journal of Food Microbiology，2011，146(2):192-199．

［5］韓雪，李研東，王穎．產(chǎn)細(xì)菌素乳酸菌的分離與篩選［J］．中國(guó)飼料，2011(7):31-32．

［6］張艾青，劉書(shū)亮，詹莉，等．產(chǎn)廣譜細(xì)菌素乳酸菌的篩選［J］．中國(guó)釀造，2007，167(2):45-48．

［7］李青青，陳啟和，何國(guó)慶，等．我國(guó)傳統(tǒng)食品中乳酸菌資源的開(kāi)發(fā)［J］．食品科學(xué)，2009，30(23):516-520．

［8］李曉紅．自然發(fā)酵面團(tuán)中乳酸菌菌株的分離與鑒定［J］．保鮮與加工，2013，13(4):45-47．

［9］張國(guó)華，何國(guó)慶．我國(guó)不同地區(qū)發(fā)酵酸面團(tuán)的菌群組成及差異研究［C］．北京:中國(guó)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)會(huì)第八屆年會(huì)暨第六屆東西方食品業(yè)高層論壇，2011-11-3．

［10］石金舟．產(chǎn)細(xì)菌素乳酸菌的篩選鑒定和細(xì)菌素發(fā)酵條件的研究［D］．合肥:安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)，2005:9-10．

［11］張銳昌，王琦，張應(yīng)龍，等．Tricine-SDS-PAGE測(cè)定小麥蛋白酶解物分子量分布［J］．食品研究與開(kāi)發(fā)，2012，33(12):168-171．

［12］PANG H，ZHANG M，QIN G，et al．Identification of lactic acid bacteria isolated fromcorn stovers［J］．Animal Science Journal，2011，82(5):642-653．

［13］GAO Y，JIA S，GAO Q，et al．A novel bacteriocin with a broad inhibitory spectrum produced by Lactobacillus sake C2，isolated from traditional Chinese fermented cabbage［J］．Food Control，2010，21(1):76-81．

［14］Oh S，Kim S H，Worobo R W．Characterization and purification of a bacteriocin produced by apotential probiotic culture，Lactobacillus acidophilus 30SC［J］．Journal of Dairy Science，2000，83(12):2 747-2 752．

［15］宮正，薛平海，顏世發(fā)，等．乳酸菌產(chǎn)細(xì)菌素研究進(jìn)展［J］．本溪冶金高等專(zhuān)科學(xué)校學(xué)報(bào)，2004，6(2):34-36．

［16］XIE Y，AN H，HAO Y，et al．Characterization of an anti-Listeriabacteriocin produced by Lactobacillus plantarum LB-B1 isolated from koumiss，a traditionally fermenteddairy product from China［J］．Food Control，2011，22(7):1 027-1 031．