宋清鵬，胡卓炎，趙雷，周沫霖，余小林

(華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，廣東廣州，510642)

紅茶菌，俗稱“海寶”，在我國(guó)具有悠久的歷史，是由酵母菌、醋酸菌、乳酸菌等幾種微生物組成的共生體。以茶糖水為培養(yǎng)液，利用紅茶菌發(fā)酵的飲料是一種很好的保健飲品。紅茶菌飲料具有幫助消化、清理腸胃、保肝［1］等保健作用。國(guó)內(nèi)外研究表明:紅茶菌飲料也具有解毒、抗癌和增強(qiáng)人體免疫力的功效［2-4］。紅茶菌飲料作為健康、安全的飲品，越來越受到人們的歡迎。紅茶菌飲料所含有的D-葡糖糖二酸1，4-內(nèi)酯(D-glucose acid 2-1，4-lactone，DSL)和D-葡萄糖二酸已被廣泛地研究。作為抗癌因子，DSL能抑制與癌癥相關(guān)的β-葡糖醛酸糖苷酶［5］。而在一定條件下DSL能與D-葡萄糖二酸進(jìn)行轉(zhuǎn)化［6］。因此，研究這兩種功能性物質(zhì)具有一定的意義。

龍眼香甜美味，潤(rùn)滑可口，是我國(guó)南方很受歡迎的水果。龍眼果肉有很高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，具有壯陽益氣、補(bǔ)益心脾、潤(rùn)膚美容等多種功效［7-8］。龍眼含糖量約為14%-18%之間［9］，可為紅茶菌的生長(zhǎng)提供部分碳源和氮源。紅茶菌結(jié)合龍眼果肉發(fā)酵可以賦予飲料新的風(fēng)味，增加其營(yíng)養(yǎng)成分。龍眼干含糖量高達(dá)30%［10］。從口感方面考慮，高糖龍眼干具有粘度大、多食則膩等缺點(diǎn);從健康方面看，高糖食品易導(dǎo)致肥胖、高血脂，誘發(fā)心臟病、糖尿病等疾病。而經(jīng)發(fā)酵后的龍眼果肉可以進(jìn)一步加工成具有獨(dú)特風(fēng)味、有益健康的低糖龍眼干。這有助于充分利用原料，降低生產(chǎn)成本，提高經(jīng)濟(jì)效益。研究不同溫度、初始糖度、接種量等因素對(duì)龍眼紅茶菌飲料發(fā)酵的影響，進(jìn)行工藝條件優(yōu)化，對(duì)進(jìn)一步的研究具有現(xiàn)實(shí)指導(dǎo)意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.2 儀器與設(shè)備

LC-10AT高效液相色譜，日本島津公司;冷凍離心機(jī)，德國(guó)ZENTRIFUGEN公司;SB-Aq色譜柱，美國(guó)安捷倫公司;UV-2550PC型島津紫外可見掃描儀分光光度計(jì)，日本島津公司;SKP-01電熱恒溫箱，湖北省黃石市醫(yī)療器械廠;HWS24電熱恒溫水浴鍋，上海一恒科學(xué)儀器有限公司;BS110S分析天平，德國(guó)Sartorius公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 工藝流程

100 mL 0.7%［11］的綠茶水+50 g龍眼果肉→接種→調(diào)糖度→8層紗布封口→恒溫箱培養(yǎng)→定期測(cè)量指標(biāo)

1.3.2 指標(biāo)測(cè)定

總酸:NaOH 滴定法［12］。

DSL和D-葡萄糖二酸:將發(fā)酵液以3500 r/min的速度離心15 min。取上清液，用流動(dòng)相稀釋10倍，經(jīng)22 μm水系濾膜過濾后進(jìn)樣分析，高效液相色譜分析條件參照張紅等(2012)的方法［13］，色譜圖見圖1。

東安三村太小，有時(shí)玩不爽快，父親就帶我和堂妹去復(fù)興公園。最刺激的是高處君臨的激流勇進(jìn)，只見堂妹手里捏緊門票，心情緊張地奔到欄桿口，等到欄桿的鐵鏈松開，她撲通一聲跳進(jìn)船里，兩手橫握扶柄。父親站在欄桿外吩咐“要當(dāng)心”時(shí)，工作人員已按住開關(guān)，我們跳上船，往矮凳上一坐，即起航了。我們握著兩只扶柄，按順序坐好，一顛一簸，有露牙說笑的，有張嘴開口的，溪水合著節(jié)節(jié)敲打的拍子，在左右都是綠樹叢林的畫面里一顛一簸地流向遠(yuǎn)處去了。堂妹走出來，樂個(gè)不停：“這游戲不夠驚險(xiǎn)，我們玩過山車去，翻的轉(zhuǎn)的都有，年輕人玩得很多，我以前嘗試過?！蹦菚r(shí)，我并不知道公園里有這么稀奇的游戲，那可都是我往常不敢玩的。

1.3.3 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

圖1 標(biāo)準(zhǔn)品(a)和樣品(b)的DSL(1)和D-葡萄糖二酸(2)色譜圖Fig.1 Chromatogram of DSL(1)and D-glucaric acid(2)of standards(a)and samples(b)

考察發(fā)酵溫度、初始可溶性固形物(TSS:total soluble solid)和接種量3個(gè)因素條件對(duì)發(fā)酵液總酸含量的影響。單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)表見表1。由于總酸與功能物質(zhì)D-葡糖糖二酸1，4-內(nèi)酯和D-葡萄糖二酸極顯著相關(guān)［14］。因此，可以通過總酸快速判斷功能性物質(zhì)的含量。圖5中的預(yù)測(cè)曲線也驗(yàn)證了功能性物質(zhì)的最優(yōu)條件也在單因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的范圍之內(nèi)。因此單因素試驗(yàn)探討發(fā)酵條件對(duì)發(fā)酵液總酸含量的影響。

表1 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)Table 1 Design of single factor

1.3.4 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

采用3因素3水平的Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，以溫度(X1)、TSS(X2)和接種量(X3)3個(gè)因素為變量，以發(fā)酵液總酸(Y1)、DSL(Y2)和D-葡萄糖二酸(Y3)為響應(yīng)值，采用期望函數(shù)途徑優(yōu)化發(fā)酵工藝參數(shù)，得出龍眼果肉發(fā)酵紅茶菌飲料的優(yōu)化條件，并進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。表2為實(shí)驗(yàn)因素和水平。

表2 Box-Behnken實(shí)驗(yàn)因素和水平Table 2 factor and level of Box-Behnken experiment

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 不同的發(fā)酵條件對(duì)發(fā)酵液總酸度的影響

溫度是影響微生物生長(zhǎng)和發(fā)酵的最重要因素之一。在一定的范圍內(nèi)，微生物的生長(zhǎng)代謝隨著溫度的升高而增加。但是當(dāng)?shù)竭_(dá)一定溫度時(shí)，就會(huì)開始不利于微生物的代謝生長(zhǎng)。繼續(xù)升高溫度，細(xì)胞可能不適于生長(zhǎng)甚至死亡。將樣品分別放置于25、30、35、40℃的恒溫條件下進(jìn)行發(fā)酵，定期測(cè)量酸度，結(jié)果見圖2。

圖2 溫度對(duì)發(fā)酵液總酸的影響Fig.2 Effect of temperature on total acid of fermentation broth

由圖2可以看出，發(fā)酵液總酸含量隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)不斷增大，且在第6天酸度達(dá)到最大值，而后趨于穩(wěn)定。30℃下產(chǎn)酸最多(28.01 g/L)，其次是35℃、25℃和40℃。溫度較低時(shí)，隨著溫度的升高，微生物細(xì)胞內(nèi)的酶活性提高，反應(yīng)加快;當(dāng)溫度過高時(shí)，細(xì)胞內(nèi)酶失活，不利于微生物生長(zhǎng)，從而產(chǎn)酸較少。

2.1.2 初始可溶性固形物含量(TSS)對(duì)總酸的影響初始可溶性固形物(TSS)對(duì)于紅茶菌的影響是兩方面的。一方面，紅茶菌的生長(zhǎng)需要足夠的碳源和氮源等，而糖就是其中之一;另一方面，TSS濃度過大，即培養(yǎng)液的滲透壓過大，微生物細(xì)胞脫水引起質(zhì)壁分離，不利于紅茶菌生長(zhǎng)與發(fā)酵［15］。因此，紅茶菌發(fā)酵需要合適的TSS，過高或者過低都不利于發(fā)酵。由圖3可以看出，初始TSS為14°Brix時(shí)，酸產(chǎn)量最高(35.87 g/L)，其次為 10、18°和 6°Brix，且在第 6 天，總酸就達(dá)到最大值，而后趨于不變。

圖3 初始可溶性固形物含量(TSS)對(duì)發(fā)酵液總酸的影響Fig.3 Effect of initial total soluble solid(TSS)on total acid of fermentation broth

2.1.3 接種量對(duì)總酸的影響

接種量對(duì)紅茶菌發(fā)酵有重要影響。生產(chǎn)上經(jīng)常通過調(diào)整接種量來提高生產(chǎn)效率和經(jīng)濟(jì)效益。大量接種紅茶菌有利于縮短發(fā)酵周期，提高產(chǎn)量。但是，接種量過大，發(fā)酵液中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)被主要用于醋酸菌的增殖，并且有大量的代謝物質(zhì)產(chǎn)生，導(dǎo)致細(xì)胞過早發(fā)生老化、自溶等現(xiàn)象［16-17］。因此，只有合適的接種量才能保證酸產(chǎn)量和經(jīng)濟(jì)效益。由圖4可知，在第6天總酸達(dá)到最大值。隨著接種量的增加，總酸越大。但當(dāng)接種量增加到18%時(shí)，酸產(chǎn)量減少。在接種量為14%時(shí)，酸產(chǎn)量最高(30.35 g/L)。

圖4 接種量對(duì)發(fā)酵液總酸的影響Fig.4 Effect of inoculation quantity on total acid of fermentation broth

2.2 期望函數(shù)途徑優(yōu)化發(fā)酵工藝參數(shù)

總酸的產(chǎn)量對(duì)于實(shí)際生產(chǎn)極其重要。而作為紅茶菌中的功能性物質(zhì)，DSL和D-葡萄糖二酸也是需要考量的重要指標(biāo)。因此，在利用Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)行工藝優(yōu)化時(shí)，將總酸(Y1)、DSL(Y2)和D-葡萄糖二酸(Y3)作為響應(yīng)值。按照表2進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，得出結(jié)果(表3)。

表3 Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 3 Design and results of response surface analysis

圖5是通過SAS V8軟件作響應(yīng)面處理得來的單因素預(yù)測(cè)曲線。在實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的范圍內(nèi)，隨著各個(gè)因素水平的增大，Y1(總酸)先增大后減小。這與本研究的單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致(圖2-4)。而Y2(DSL)和Y3(D-葡萄糖二酸)的變化趨勢(shì)與總酸一致，這也說明了Y2和Y3兩種功能性物質(zhì)的最佳發(fā)酵條件在本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)范圍之內(nèi)。

圖5 響應(yīng)值對(duì)不同單因素的預(yù)測(cè)曲線Fig.5 Prediction profile of responses to different factors

2.2.1 總酸

通過SAS V8軟件進(jìn)行二次回歸擬合，得出了Y1(總酸)的二次回歸方程為:

表4中對(duì)Y1(總酸)的方差分析結(jié)果表明，該模型的Prob＞F值＜0.01。這說明該模型是極顯著的。而失擬項(xiàng)(＞0.05)不顯著。與此同時(shí)，該模型的相關(guān)系數(shù)為99.25%，遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于90%。這說明模型的相關(guān)度很好，可以很好地預(yù)測(cè)結(jié)果。模型中P(X1)和P(X3)均小于0.05，而P(X2)大于0.05，這說明X1(溫度)和X3(接種量)對(duì)Y1(總酸)顯著，而X2(TSS)則對(duì)總酸不顯著。X1和X3之間的交互作用較顯著，其他交互作用不顯著。F值能在相同自由度的情況下代表某個(gè)因素對(duì)于響應(yīng)值的重要性。從表5可以看出，F(xiàn)(X1)＞F(X3)＞F(X2)。因此，各因素對(duì)度龍眼果肉發(fā)酵紅茶菌飲料的總酸影響程度大小順序?yàn)?X1(溫度)＞X3(接種量)＞X2(TSS)。

2.2.2 D-葡糖糖二酸 1，4-內(nèi)酯(DSL)

同理分析得到Y(jié)2(DSL)的二次回歸方程:

該模型的Prob＞F值＜0.01，所以該模型是極顯著的;失擬項(xiàng)不顯著;而決定系數(shù)R2=99.02%，這說明該模型的相關(guān)度很好，能夠很好地反應(yīng)真實(shí)數(shù)據(jù)。X1、X2和X2的P值均小于0.05。因此，各因素對(duì)Y2(DSL)均顯著。X1、X3之間的交互作用顯著(圖6(a))，而其他單因素之間的交互作用不顯著。隨著X1(溫度)和X3(接種量)同時(shí)增大，Y2(DSL)的含量逐漸增加到最大值，而后又慢慢變小。分析F值，可以得到，各因素對(duì)DSL合成量的影響大小順序?yàn)?X2(TSS)，X3(接種量)，X1(溫度)。這是因?yàn)?DSL是由D-葡萄糖二酸轉(zhuǎn)化而來。而D-葡萄糖二酸來源于醋酸菌分解蔗糖后得到的葡萄糖［18］。因此，蔗糖的量(TSS)對(duì)DSL的合成量影響最大。

表4 各響應(yīng)值的方差析表Table 4 ANOVA for different responses

2.2.3 D-葡萄糖二酸

分析得到Y(jié)3的二次回歸方程如下:

該模型極顯著，失擬項(xiàng)不顯著，說明模型擬合較好。決定系數(shù)R2=99.25%，即該模型相關(guān)度極好。同上分析表4，單因素X1(溫度)、X2(TSS)和X3(接種量)對(duì)Y3(D-葡萄糖二酸)均為顯著。與Y2模型中結(jié)果一致，3因素之間中只有X1、X3的交互作用顯著(圖6)。當(dāng)X1(溫度)X3(接種量)均增大時(shí)，Y3(D-葡萄糖二酸)增大到最大值再逐漸變小。同時(shí)這也在某種程度上驗(yàn)證了DSL和D-葡萄糖二酸之間有一定的關(guān)系。而事實(shí)研究也表明兩種功能性物質(zhì)之間可以進(jìn)行轉(zhuǎn)化［6］。各單因素 F值說明X2(TSS)對(duì) Y3(D-葡萄糖二酸)的影響最大，其次是X3(接種量)和X1(溫度)。

2.2.4 最佳條件的篩選

圖6 溫度和接種量對(duì)DSL和D-葡萄糖二酸影響Fig.6 Effect of temperature andinoculation quantity on DSL and D-glucaric acid

利用SAS軟件進(jìn)一步對(duì)數(shù)據(jù)分析計(jì)算，將Y2(DSL)作為優(yōu)先考慮的響應(yīng)值，得出一系列總酸的較優(yōu)發(fā)酵條件。在這些條件中篩選出比較適合響應(yīng)值Y1(總酸)和Y3(D-葡萄糖二酸)的較優(yōu)的水平條件:X1(溫度)為 -0.07，X2(TSS)為 0.09，X3(接種量)為0.15。轉(zhuǎn)換后的實(shí)際條件X1(溫度)為29.6℃，X2(TSS)為14.7°Brix，X3(接種量)為14.1%。依此條件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，測(cè)得發(fā)酵液的總酸為26.87 g/L，DSL為4.51 g/L，D-葡萄糖二酸為18.01 g/L(表5)。T檢驗(yàn)結(jié)果表明，各項(xiàng)指標(biāo)的實(shí)驗(yàn)值與預(yù)測(cè)值無顯著性差異。這進(jìn)一步說明模型能夠準(zhǔn)確地預(yù)測(cè)結(jié)果。

表5 優(yōu)化條件下的實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 5 results under optimal condition of fermentation

3 結(jié)論與展望

(1)利用龍眼果肉結(jié)合紅茶菌進(jìn)行發(fā)酵的最佳條件為:溫度29.6℃，初始可溶性固形物為14.7°Brix，接種量為14.1%，發(fā)酵時(shí)間6d。依此條件進(jìn)行發(fā)酵，所得發(fā)酵液總酸含量為26.87 g/L，DSL為4.51 g/L，D-葡萄糖二酸為 18.01 g/L。

(2)紅茶菌的發(fā)酵賦予了龍眼果肉特殊的風(fēng)味和功能性成分。經(jīng)發(fā)酵后的龍眼果肉可以進(jìn)一步加工成有益健康的低糖龍眼干。這樣可以高效利用原料，節(jié)約成本，提高經(jīng)濟(jì)效益，具有現(xiàn)實(shí)的生產(chǎn)意義。

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