侯曉慧，張金澤，林靜，段素芳，高加濤，周志橋

(中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院，北京，100015)

低聚半乳糖(galactooligosaccharide，GOS)被認(rèn)為是和母乳低聚糖結(jié)構(gòu)最相近的低聚糖，已批準(zhǔn)應(yīng)用于嬰幼兒配方食品之中［1］。低聚半乳糖根據(jù)其糖苷鍵結(jié)構(gòu)的不同，可分為 α-型和 β-型的低聚半乳糖［2］，目前工業(yè)生產(chǎn)的低聚半乳糖，以乳糖為原料，通過半乳糖苷酶的作用，得到β-型的低聚半乳糖［3-4］，其過程是乳糖水解產(chǎn)生的半乳糖基，連接到另一個乳糖的半乳糖基上，形成葡萄糖-半乳糖-半乳糖的所謂半乳三糖。半乳糖基再連接到半乳三糖上，形成半乳四糖，結(jié)構(gòu)為:葡萄糖-半乳糖-半乳糖-半乳糖，并可進(jìn)一步形成半乳五糖、半乳六糖等等，也可生成半乳糖-半乳糖，半乳糖-半乳糖-半乳糖等低聚糖混合物。

澤蘭中含有棉子糖(果糖-葡萄糖-半乳糖)、水蘇糖(果糖-葡萄糖-半乳糖-半乳糖)、毛蕊五糖(果糖-葡萄糖-半乳糖-半乳糖-半乳糖)等 α-型的低聚糖［5］。使用微生物發(fā)酵的方法，可以定向把澤蘭低聚糖中的果糖剪切下來并加以利用，得到新型的α-型低聚半乳糖，其糖基的組成和用乳糖為原料生產(chǎn)的低聚糖一致，包括蜜二糖(葡萄糖-半乳糖)、半乳三糖(葡萄糖-半乳糖-半乳糖)、半乳四糖(葡萄糖-半乳糖-半乳糖-半乳糖)、半乳五糖(葡萄糖-半乳糖-半乳糖-半乳糖-半乳糖)等。本實驗在已篩選出符合實驗條件的菌株和進(jìn)行了前期單因素試驗的基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面法對其發(fā)酵條件做進(jìn)一步優(yōu)化，以期得到更高含量的α-低聚半乳糖產(chǎn)品。

1 材料和方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料

酵母菌(yeast，編號 SB)，北京君悅誠品科貿(mào)有限公司;酵母膏，北京奧博星生物技術(shù)有限公司;Mg-SO4(化學(xué)純)，北京五七六零一化工廠;KH2PO4(分析純)，西隴化工股份有限公司;MRS培養(yǎng)基(CM188)北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司;營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基(CM142)，北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司。

初始發(fā)酵培養(yǎng)基:酵母膏1.5 g/100 mL，MgSO4·7H2O 0.05 g/100 mL，KH2PO40.1 g/100 mL，溶于澤蘭浸提液，pH=(6.5±0.2)。

1.1.2 設(shè)備儀器

立式壓力蒸汽滅菌器(YXQ-LS-75G)，上海東亞壓力容器制造有限公司;厭氧培養(yǎng)箱(XL-YY)，上海馨朗電子科技有限公司;智能恒溫恒濕培養(yǎng)箱(FJX-158S)，寧波海曙賽福實驗儀器廠;高效液相色譜儀、示差檢測器(LC10-AT)，日本島津公司;色譜柱(氨基鍵合柱 Hypersil-NH2，填料粒徑 5 μm，柱子尺寸 Φ 4.6 mm×250 mm)，大連依利特公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 發(fā)酵條件的優(yōu)化設(shè)計

1.2.1.1 Plackett-Burman設(shè)計

通過單因素試驗發(fā)現(xiàn)，影響α-低聚半乳糖含量的主要因素有:發(fā)酵溫度、菌種接種量、初始糖濃度、酵母膏、MgSO4·7H2O和 KH2PO46個因素。用Plackett-Burman設(shè)計對以上6個因素進(jìn)行全面考察，選用N=12的 P-B設(shè)計，G～L為虛擬變量，用來估計實驗誤差。各因素試驗設(shè)計水平見表1，實驗結(jié)果用Design-Expert軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

表1 Plackett-Burman試驗設(shè)計水平Table 1 Experimental levels of Plackett-Burman

1.2.1.2 最陡爬坡試驗接近最大響應(yīng)區(qū)域

（1）進(jìn)一步完善制度建設(shè)，加強(qiáng)制度落實。在全面貫徹執(zhí)行國家有關(guān)規(guī)定及建設(shè)單位管理制度的基礎(chǔ)上，根據(jù)項目特點，針對性地補(bǔ)充完善各項管理制度（如：《航道疏浚施工控制要點》），作為企業(yè)內(nèi)部的執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)。并通過舉辦培訓(xùn)班、班前教育等活動，使參建人員熟悉各項相應(yīng)的管理制度。制定各項責(zé)任制（如：《技術(shù)、安全交底責(zé)任制》），明確崗位職責(zé)，加大考評、檢查及獎懲力度，使大家知道該干什么、怎么干等。

根據(jù)P-B設(shè)計結(jié)果篩選出影響α-低聚半乳糖含量的顯著因素，并以各顯著因素的正負(fù)效應(yīng)確定下一步試驗的最陡爬坡路徑(包括變化方向和變化步長)，快速地逼近最佳區(qū)域。試驗設(shè)計見表2。

表2 最陡爬坡試驗設(shè)計Table 2 Experimental design of steepest ascent

1.2.1.3 響應(yīng)面試驗設(shè)計

通過Plackett-Burman試驗確定出影響α-低聚半乳糖含量的主要因素，進(jìn)而由最陡爬坡試驗確定接近響應(yīng)值區(qū)域顯著因素的濃度，利用Box-Behnke試驗設(shè)計進(jìn)一步優(yōu)化。其試驗設(shè)計見表3。每個因素有3個水平，以α-低聚半乳糖含量為響應(yīng)值，實驗數(shù)據(jù)用Design-Expert軟件進(jìn)行多項式回歸分析。

表3 Box-Behnke試驗設(shè)計Table 3 Experimental levels of Box-Behnke

1.2.2 發(fā)酵條件

澤蘭經(jīng)3遍80℃左右熱水浸泡榨汁得到浸提液，添加菌種及各種營養(yǎng)成分，放入恒溫?fù)u床培養(yǎng)箱中培養(yǎng)一定時間后取樣測定。

1.2.3 α-低聚半乳糖含量的測定

發(fā)酵結(jié)束后，取50 mL糖液，加0.5 g活性炭對糖液進(jìn)行脫色，加熱至80℃攪拌30 min左右，過濾，濾液稀釋至折光1.0，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾到樣品中，用HPLC分析測定。

2 結(jié)果與分析

2.1 Plackett-Burman設(shè)計篩選影響α-低聚半乳糖含量的主要因素

試驗設(shè)計及結(jié)果見表4。因素G-K為dummy variables。每組試驗有3個重復(fù)，以平均值為準(zhǔn)。

各因素參數(shù)效應(yīng)分析見表5，由表5可知，對α-低聚半乳糖含量有顯著影響(可信度＞90%)的發(fā)酵條件因素包括發(fā)酵溫度、初始糖濃度、酵母膏和KH2PO44個，且均為顯著負(fù)效應(yīng)。由此，接下來的試驗主要考察這4個因素，且應(yīng)適當(dāng)降低各因素水平。

表4 Plackett-Burman試驗設(shè)計及結(jié)果Table 4 Experimental design and results of Plackett-Burman

表5 Plackett-Burman試驗結(jié)果各參數(shù)分析Table 5 Parameter analysis and estimates of Plackett-Burman

2.2 最陡爬坡試驗接近最大響應(yīng)面區(qū)域

根據(jù)Plackett-Burman試驗結(jié)果，及初始糖濃度、發(fā)酵溫度、酵母膏和KH2PO44個因素效應(yīng)大小的比例，設(shè)定它們的變化方向和步長，其他因素分別取各自的低水平進(jìn)行試驗，試驗設(shè)計及結(jié)果見表6。由表6可知，隨著4個重要因素的不同變化，糖液中α-低聚半乳糖含量的變化趨勢是先上升后下降，其中第4組的α-低聚半乳糖含量最高，響應(yīng)變量接近最大響應(yīng)區(qū)域，所以以第4組條件為中心點進(jìn)行響應(yīng)面分析。

表6 最陡爬坡試驗設(shè)計及結(jié)果Table 6 Experimental design and results of steepest ascent

2.3 Box-Behnke試驗設(shè)計重要因素的最優(yōu)水平

以發(fā)酵溫度、初始糖濃度、酵母膏和KH2PO44個重要因素為自變量，試驗設(shè)計及結(jié)果見表7。

以α-GOS(Y)含量為響應(yīng)值，利用Design-Expert軟件對表7的結(jié)果進(jìn)行回歸擬合，得到二階回歸方程為:Y=94.52+(1.410 17E-015)A-0.575B-(1.281 98E-015)C+0.025D-0.125AB-0.075AC+0AD+0.275BC+0.325BD+0.15CD-3.26A2-2.397 5B2-1.36C2-1.122 5D2。此數(shù)學(xué)模型的方差分析結(jié)果如表8所示，相關(guān)系數(shù)達(dá)到0.98，說明模型對實際情況的擬合較好。因此可用回歸方程對最佳發(fā)酵條件進(jìn)行預(yù)測。

表7 Box-Behnke試驗設(shè)計及結(jié)果Table 7 Experimental design and results of Box-Behnke

表8 回歸模型方程的方差分析Table 8 Analysis of variance(ANOVA)of regression model of quadratic response

2.4 響應(yīng)面分析及最佳發(fā)酵條件確定

利用Design-Expert軟件對回歸模型進(jìn)行響應(yīng)面分析，得到各響應(yīng)面立體分析模型及等高線圖，見圖1～圖8。

圖1 Y=f(A，B)的響應(yīng)曲面Fig.1 Response surface of Y=f(A，B)

圖2 Y=f(A，C)的響應(yīng)曲面Fig.2 Response surface of Y=f(A，C)

圖3 Y=f(A，D)的響應(yīng)曲面Fig.3 Response surface of Y=f(A，D)

圖4 Y=f(B，C)的響應(yīng)曲面Fig.4 Response surface of Y=f(B，C)

圖5 Y=f(B，D)的響應(yīng)曲面Fig.5 Response surface of Y=f(B，D)

圖6 Y=f(C，D)的響應(yīng)曲面Fig.6 Response surface of Y=f(C，D)

由圖1～圖3可以看出，在較低發(fā)酵溫度時(＜28℃)α-低聚半乳糖含量有隨發(fā)酵溫度增高而增加的趨勢，在較高發(fā)酵溫度時(＞28℃)α-低聚半乳糖含量有隨發(fā)酵溫度增高而減少的趨勢;在發(fā)酵溫度不變的條件下，α-低聚半乳糖含量隨初始糖濃度、酵母膏或KH2PO4濃度的增大呈先增加后減少的變化趨勢，且在中心點附近的低濃度和高濃度的變化程度相接近。由圖4～圖5可以看出，在較低初始糖濃度時(＜9°Brix)α-低聚半乳糖含量有隨初始糖濃度增大而增加的趨勢，在較高初始糖濃度時(＞9°Brix)α-低聚半乳糖含量有隨初始糖濃度增大而減少的趨勢，且后者的變化程度明顯顯著于前者;在初始糖濃度不變的條件下，α-低聚半乳糖含量隨酵母膏或KH2PO4濃度的增大呈先增加后減少的變化趨勢。由圖6可以看出，在較低酵母膏濃度時(＜1.2 g/100 mL)，α-低聚半乳糖含量有隨酵母膏濃度的增大而增加的趨勢，在較高酵母膏濃度時(＞1.2 g/100 mL)，α-低聚半乳糖含量有隨酵母膏濃度的增大而減少的趨勢，但是變化程度不明顯;在酵母膏濃度不變的條件下，α-低聚半乳糖含量隨KH2PO4濃度的增大呈先增加后減少的變化趨勢，但是變化趨勢也不是非常明顯。

綜合圖1～圖6分析結(jié)果，發(fā)酵溫度、初始糖濃度、酵母膏和KH2PO4均對發(fā)酵液中α-低聚半乳糖含量有顯著影響，其中發(fā)酵溫度和初始糖濃度的作用更加顯著。四者之間存在交互影響作用，與方差分析結(jié)果一致。

通過響應(yīng)優(yōu)化器分析知α-低聚半乳糖含量的最大值出現(xiàn)在A、B、C、D 的編碼值分別為(0，-0.12，-0.01，-0.01)時，即發(fā)酵溫度為28℃、初始糖濃度為8.76°Brix、酵母膏濃度為 1.2 g/100 mL、KH2PO4濃度為0.21 g/100 mL時，此時α-低聚半乳糖含量達(dá)到最大值為94.55%。以此條件進(jìn)行微生物發(fā)酵，三次發(fā)酵進(jìn)行試驗驗證，得到 α-低聚半乳糖含量為94.0%，這與預(yù)測值基本吻合。經(jīng)HPLC分析測定的結(jié)果見圖7。

圖7 α-低聚半乳糖圖譜Fig.7 The fingerprint of α-GOS

3 結(jié)論

本實驗通過Plackett-Burman設(shè)計及響應(yīng)面分析，確定了微生物發(fā)酵的最佳條件為發(fā)酵溫度28℃、初始糖濃度8.76°Brix、酵母膏濃度1.2 g/100 mL、KH2PO4濃度0.21 g/100 mL。綜合以上工藝參數(shù)對澤蘭浸提液進(jìn)行微生物發(fā)酵試驗得到的發(fā)酵液中α-低聚半乳糖含量為93.7%，比優(yōu)化前含量提高了近8%。

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［3］ 薛雅鶯，袁衛(wèi)濤，楊海軍.低聚半乳糖的特性及應(yīng)用前景［J］.發(fā)酵科技通訊，2011，40(3):50-52.

［4］ Duarte P M Torres，Maria do Pilar F Goncalves，Jose A Teixeira， etal. Galacto-oligosaccharides:production，properties，applications， and significance as prebiotics［J］.Comprehensive Reviews in Food Science and Food Safety，2010，9(5):438-454.

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