李建龍，王志龍，劉書亮，姚開，鄧維琴，黃道梅，賴海梅

1(四川農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，四川 雅安，625014)

2(四川大學(xué)輕紡與食品學(xué)院，四川成都，610065)

擬除蟲菊酯類農(nóng)藥具有高效、低毒、選擇性好等優(yōu)點，已在全世界范圍內(nèi)被廣泛使用。該類農(nóng)藥對光、熱具有穩(wěn)定性，自然條件下難迅速降解［1-2］，長期接觸有致畸、致癌、致突變的危險［3-4］。3-PBA是大多數(shù)擬除蟲菊酯類農(nóng)藥的分解產(chǎn)物之一［5-6］，與擬除蟲菊酯類農(nóng)藥相比，在環(huán)境中的遷移速率更快，在土壤中的半衰期長達180 d左右［7］，遠遠長于大多數(shù)擬除蟲菊酯殺蟲劑約30 d的半衰期。3-PBA對微生物的生長具有一定的抑制作用，能阻止擬除蟲菊酯類農(nóng)藥的徹底降解，從而使得該類農(nóng)藥難以被生物降解為無毒小分子［8］，因此3-PBA對生態(tài)環(huán)境和人類健康的潛在危害性較菊酯類殺蟲劑大［9］。微生物降解效率高、無二次污染，且可有效降低環(huán)境中的有毒污染物［10］，但其降解效率可能低于其降解酶［11］，且菌株產(chǎn)生的降解酶對環(huán)境條件的忍受范圍比菌體寬［12］，酶又是一類蛋白質(zhì)，安全性比微生物更高［13］。Chen等分離到多株可降解3-PBA的菌株，如Ochrobactrum lupini［14］、Streptomyces aureus［15］、Bacillus sp.［16］、Stenotrophomonas sp.［17］，并研究了降解菌株的降解特性及降解途徑等，但未進行3-PBA降解酶研究;許育新等［18］分離到1 株P(guān)seudomonas sp.PBM11 菌株，24h可完全降解200 mg/L的3-PBA，并提取PBM11菌株的質(zhì)粒，推斷3-PBA降解酶基因可能位于質(zhì)粒上;邱吉國等［19］分離到1株可降解乙羧氟草醚的菌株(Pseudomonas sp.)，乙羧氟草醚和3-苯氧基苯甲酸都含有二苯醚鍵結(jié)構(gòu)，實驗中檢測到菌株細胞內(nèi)鄰苯二酚1，2-雙加氧酶對乙羧氟草醚有活性，推斷乙羧氟草醚降解途徑是先醚鍵斷裂然后脫去苯環(huán)上的側(cè)鏈，最終通過鄰苯二酚1，2-雙加氧酶裂解開環(huán)。

本文針對1株可高效降解3-PBA的鞘氨醇單胞菌SC-1(在MM培養(yǎng)基中，30℃，16 h可將300 μg/mL 3-PBA完全降解)，研究其產(chǎn)3-苯氧基苯甲酸(3-PBA)降解酶的細胞定位，并對該降解酶進行Native-PAGE和SDS-PAGE電泳，初步確定酶的分子質(zhì)量，為深入研究3-PBA降解酶提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

鞘氨醇單胞菌(Sphingomonas sp.)SC-1，由四川農(nóng)業(yè)大學(xué)食品微生物實驗室分離保藏，可高效降解3-PBA(在MM培養(yǎng)基中，30℃，16 h可將300 μg/mL 3-PBA完全降解)。

1.1.2 培養(yǎng)基

LB固體培養(yǎng)基:酵母膏5 g;蛋白胨10 g;NaCl 10 g;瓊脂2 g;水1 000 mL;調(diào)pH值至7.0;加入3-PBA至終濃度 100 μg/mL。

LB液體培養(yǎng)基作為發(fā)酵種子培養(yǎng)基。

MM培養(yǎng)基:(NH4)2SO41.5 g;MgSO40.2 g;NaCl 0.5 g;KH2PO40.5 g;K2HPO41.5 g;蒸餾水1 000 mL;pH 7.5，3-PBA 濃度為 100 μg/mL。

發(fā)酵培養(yǎng)基:(NH4)2SO41.5 g;MgSO40.5 g;NaCl 0.5 g;KH2PO40.5g;K2HPO41.5 g;葡萄糖5.0 g;酵母浸出粉5.0 g;水1 000 mL;調(diào)節(jié)pH值至7.0;加入3-PBA 至 100 μg/mL。

以上培養(yǎng)基均121℃滅菌15 min。

1.1.3 藥品及試劑

3-苯氧基苯甲酸(98%)，Sigma公司;檢測用乙腈(色譜純)，德國CNW Technologies GmbH公司;丙烯酰胺，成都溶海公司;甲叉雙丙烯酰胺，Sigma公司;SDS，美國Amresco公司;TEMED(進口分裝);過硫酸銨，上海諾倫生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司;考馬斯亮藍R-250，天根生化科技(北京)有限公司;蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標準(低)，天根生化科技(北京)有限公司;溴酚藍，天津市巴斯夫化工有限公司。

PBS緩沖液:用 KH2PO4及 K2HPO4配制 0.02 mol/L、pH 7.0的磷酸鹽緩沖液。

PBS底物緩沖液:將3-PBA充分溶于0.02 mol/L、pH 7.0的PBS緩沖溶液中，分別制成5 μg/mL及20 μg/mL的PBS底物緩沖溶液。

其他化學(xué)試劑均為進口或國產(chǎn)分析純。

1.1.4 主要儀器設(shè)備

UV-3200紫外可見分光光度計，上海美譜達儀器有限公司;RZ-10L發(fā)酵罐，南京瑞澤生物工程設(shè)備有限公司;LC-10A2010C HT型液相色譜儀(配有可變波長紫外檢測器，LC-solution工作站)，日本Shimazu公司;Gel Doc XR凝膠成像儀，BIO-RAD公司;Milli-Q Gradient超純水系統(tǒng)，Millipore公司;Scientz-ⅡD超聲波細胞破碎儀，寧波新芝生物科技股份有限公司;DSHZ-300水浴恒溫多用途搖床培養(yǎng)箱，江蘇太倉市實驗設(shè)備廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 3-PBA降解酶的細胞定位

1.2.1.1 發(fā)酵液的制備

從平板上挑取SC-1單菌落，劃線于LB斜面培養(yǎng)基上，30℃恒溫培養(yǎng)24 h。用無菌生理鹽水將SC-1菌苔從斜面培養(yǎng)基上洗脫并混勻制成菌懸液，接種1.0 mL SC-1菌懸液(菌濃度約為108CFU/mL)于30 mL發(fā)酵培養(yǎng)基中，30℃，180 r/min恒溫搖振培養(yǎng)24 h得種子液，將種子液按3%接種至發(fā)酵罐，發(fā)酵罐裝料系數(shù)0.65，接種量6.25%，起始pH 7.0，發(fā)酵溫度30℃，轉(zhuǎn)速控制在300 r/min，發(fā)酵罐壓維持在0.04～0.05 MPa，產(chǎn)泡較多時加少量無菌消泡油進行消泡。發(fā)酵培養(yǎng)24 h，得到SC-1發(fā)酵混合液。

發(fā)酵結(jié)束后將SC-1發(fā)酵混合液冷凍離心(4℃，10 000 r/min，10 min)，離心分別收集上清液及菌體沉淀，菌體沉淀用0.02 mol/L PBS緩沖液懸浮清洗2次后于-20℃低溫保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.1.2 3-PBA降解酶初步定位

胞外酶液:在冰水浴下，向500 mL的SC-1發(fā)酵上清液中緩慢加入烘干研細的(NH4)2SO4粉末，并同時利用磁力攪拌器進行攪勻，使(NH4)2SO4飽和度逐漸達到100%，4℃鹽析過夜。低溫冷凍離心(4℃，10 000 r/min，10 min)收集鹽析液中蛋白沉淀，用0.02 mol/L PBS緩沖液溶解蛋白沉淀，并于4℃條件下透析(透析袋截留系數(shù)MWCO=14 000)直至氯化鋇溶液檢測透析液中無SO42-，4 ℃條件下用聚乙二醇20000濃縮酶液至1 mL。

胞內(nèi)粗酶液和菌體細胞碎片液:將SC-1菌體室溫解凍，稱取1.0 g濕菌體，按1 g菌體+4 mL PBS緩沖液的比例重懸，冰浴中超聲破碎(功率290 W，工作1 s，間歇3 s)菌懸液1 200 s，4 ℃10 000 r/min離心10 min，上清液為SC-1胞內(nèi)粗酶液。沉淀用PBS緩沖液重懸離心清洗2次，再向沉淀中加入4 mL PBS緩沖液重懸，即細胞碎片液。

降解酶活力測定:取0.5 mL的20 μg/mL PBS底物緩沖液與0.4 mL PBS緩沖溶液混勻，30℃保溫10 min后加入粗酶液0.1 mL，水浴搖振反應(yīng)10 min，1 mL乙腈終止反應(yīng)。以加入酶液后立即用乙腈終止反應(yīng)的樣品為空白對照，HPLC檢測反應(yīng)體系中3-PBA殘留量。

1.2.1.3 3-PBA 的檢測方法［8］

樣品處理:色譜純乙腈終止體系反應(yīng)并定容至10 mL，混勻后10 000 r/min離心10 min，取上清液過有機相濾膜，棄去初濾液，取續(xù)濾液用于 HPLC檢測［8］。

HPLC檢測條件:色譜柱:Gemini 100? C18柱(5.0 μm，150 mm ×4.60 mm，i.d.)，流動相為 V(乙腈)∶V(磷酸水)=55∶45，磷酸水 pH=2.5，流速為0.7 mL/min，進樣量為10 μL，檢測波長為210 nm，柱溫 25 ℃［8］。

3-苯氧基苯甲酸降解酶的酶活力定義:在本實驗條件下，1.0 min內(nèi)使3-PBA減少1.0 nmol所需要的酶量為1個酶活力單位(U)。

3-PBA殘留量(μg/mL)計算:

式中:Cx，3-PBA殘留量;C0，樣品中3-PBA初始濃度;Sx，樣品中殘留3-PBA的峰面積;S0，樣品中初始3-PBA的峰面積。

1.2.1.4 細胞膜片段的分離

將重懸后的細胞碎片液于冰水浴中超聲破碎(功率290 W，工作1 s，間歇3 s)1 200 s。向10 mL透明離心管中加入1 mL 37%蔗糖溶液，再用注射器緩慢向37%蔗糖溶液底部注入3 mL 41%蔗糖溶液，使之形成清晰的蔗糖梯度濃度界面。取0.4 mL破碎細胞碎片液沿管壁緩慢旋轉(zhuǎn)加入至蔗糖溶液表面，4℃離心(12 000 r/min，20 min)，收集蔗糖梯度界面層霧狀細胞膜［20］。4℃透析除去霧狀細胞膜中的高濃度蔗糖溶液，4℃條件下用聚乙二醇20000濃縮至少量細胞膜懸浮液。收集蔗糖密度梯度離心的細胞碎片，用PBS緩沖液清洗離心2次，再恢復(fù)細胞碎片至蔗糖密度梯度離心前原體積。

分別向0.5 mL細胞膜濃縮液和0.1 mL細胞碎片懸液中加入0.5 mL 5 μg/mL PBS緩沖液，補足反應(yīng)體系至1.0 mL，30℃水浴、搖振反應(yīng)2 h后，1 mL乙腈終止反應(yīng)。以加入PBS底物緩沖液后立即用乙腈終止反應(yīng)的樣品為空白對照，HPLC檢測反應(yīng)體系中3-PBA殘留量。

1.2.2 3-PBA降解酶分子質(zhì)量的初步確定

1.2.2.1 Native-PAGE分離膜蛋白及切膠回收作3-PBA降解反應(yīng)

將密度梯度離心所得的細胞膜片段懸浮液置于冰水浴中超聲破碎 (功率50 W，工作1 s，間歇3 s)2 400 s，破碎后置于透析袋(透析袋截留系數(shù)MWCO=14 000)中，于4℃用聚乙二醇20000濃縮至少量膜片段懸液。

取Native-PAGE樣品緩沖液50 μL與膜片段懸液樣品200 μL混合，不經(jīng)離心取樣品混合液直接上樣。恒定電壓90 V電泳至樣品進入分離膠，提高電壓至120 V電泳，待溴酚藍接近膠邊緣0.5 cm處，電泳結(jié)束，取一塊凝膠用蛋白染色液進行染色1 h，脫色液脫色，直至出現(xiàn)清晰條帶;另一塊凝膠用Native-PAGE電泳緩沖液浸泡，4℃暫存。

凝膠配方參見《蛋白質(zhì)純化技術(shù)及應(yīng)用》［21］(表1)。

取另一塊Native-PAGE凝膠，比對蛋白染色后的凝膠分別對電泳條帶進行切膠回收。取相同重量的聚丙烯酰胺凝膠分別研碎，加入0.5 mL 5 μg/mL PBS底物緩沖液及3.0 mL PBS緩沖液，30℃水浴搖振反應(yīng)24 h，以加入蛋白染色無條帶的凝膠反應(yīng)體系為空白對照。色譜純乙腈終止反應(yīng)并定容至10 mL體系，HPLC檢測反應(yīng)體系中3-PBA殘留量。

表1 Native-PAGE凝膠配方Table 1 Gel composition of Native-PAGE gel

1.2.2.2 3-PBA降解酶SDS-PAGE

切膠回收作3-PBA降解反應(yīng)時，有3-PBA降解活性的蛋白條帶，將此條帶凝膠切成小塊，完全浸沒于含SDS-PAGE電泳緩沖溶液的透析袋中，于水平電泳槽上對凝膠中的蛋白進行電泳洗脫(電壓200 v，洗脫時間8 h)。離心電泳洗脫液得上清液，于4℃條件下用聚乙二醇20000濃縮至少量，取SDS-PAGE樣品緩沖液50 μL與濃縮后樣品200 μL混合，沸水浴5 min，10，000 r/min 離心 5 min，直接取樣品混合上清液上樣，電泳及染色同Native-PAGE。

SDS-PAGE凝膠制備參見《蛋白質(zhì)純化技術(shù)及應(yīng)用》［21］(表 2)。

表2 SDS-PAGE凝膠配方Table 2 Gel composition of SDS-PAGE gel

2 結(jié)果與分析

2.1 3-PBA降解酶的細胞定位

鞘氨醇單胞菌SC-1細胞不同部位3-PBA降解酶活性如圖1所示?？梢钥闯?，活細胞菌懸液的3-PBA降解酶活性最高，胞外粗酶液、胞內(nèi)粗酶液及細胞碎片粗酶液均有3-PBA降解酶活性，但3-PBA降解酶活性主要集中于細胞碎片中，胞外粗酶液及胞內(nèi)粗酶液的活性較低，這可能與粗酶液制備時的菌體細胞及碎片殘留于胞外、胞內(nèi)粗酶液有關(guān)。

圖1 菌株SC-1細胞不同部位3-PBA降解酶活性Fig.1 Activity of 3-PBA-degrading enzymes from different parts of SC-1

鞘氨醇單胞菌SC-1細胞膜降解3-PBA的HPLC色譜圖如圖 2 所示，1#、2#、3#、4#、5#為非目標峰(培養(yǎng)基雜質(zhì)峰或細菌代謝產(chǎn)物峰)，6#為目標峰(3-PBA)，出峰時間為7.21 min。SC-1細胞碎片再次破碎并經(jīng)蔗糖密度梯度離心等多步處理后，其分離得到的細胞膜對3-PBA仍有一定的降解酶活性，且有疑似降解產(chǎn)物苯酚的生成［8］，說明在鞘氨醇單胞菌SC-1中3-PBA降解酶位于細胞膜上。而細胞碎片懸液對3-PBA降解率高于細胞膜懸液可能是:(1)超聲處理雖然能使部分細胞膜從碎片上剝離下來，但細胞碎片上仍吸附有細胞膜;(2)雖經(jīng)過超聲波細胞破碎，但由于未能完全破碎菌體，因此細胞碎片中仍有完整的活細胞;(3)將細胞膜剝離后其穩(wěn)定性降低。

圖2 鞘氨醇單胞菌SC-1細胞膜降解3-PBA的HPLC色譜圖Fig.2 The chromatogram of degrading 3-PBA by the cytomembrane of Sphingomanas sp.SC-1

2.2 鞘氨醇單胞菌SC-1中3-PBA降解酶的分離

將蔗糖密度梯度離心后得到的細胞膜再次破碎濃縮，并對其進行Native-PAGE電泳后染色(圖3)，針對染色后的主要條帶將未染色凝膠進行切膠回收，破碎后的細胞膜電泳時出現(xiàn)多條蛋白條帶。

圖3 鞘氨醇單胞菌SC-1細胞膜Native-PAGE圖Fig.3 The Native-PAGE diagram of the cytomembrane of Sphingomanas sp.SC-1

Dehmel等［22］得出蛋白質(zhì)在Native-PAGE中的遷移率主要取決于它所帶電荷及分子大小，因此對分離膠中疑似降解酶的條帶a、b及c進行切膠回收和3-PBA降解反應(yīng)?；厥盏鞍讞l帶降解3-PBA的HPLC色譜圖如圖4所示，7#、8#、9#為非目標峰(雜質(zhì)峰)，10#為目標峰(3-PBA)，出峰時間為7.21 min，條帶a及條帶b未檢測有3-PBA降解活性，條帶c在24 h內(nèi)對0.5 mL、5 μg/mL 3-PBA的降解率為22.23%，仍具有一定的降解活性，見圖4。

圖4 回收蛋白條帶降解3-PBA的HPLC色譜圖Fig.4 The chromatogram of degrading 3-PBA by the protein recovered

對Native-PAGE凝膠中的條帶c進行切膠回收，條帶c經(jīng)電泳洗脫濃縮后與細胞膜破碎液一同進行SDS-PAGE，結(jié)果見圖5。條帶c在SDS-PAGE上出現(xiàn)2條條帶，其分子質(zhì)量約為50～90 ku，推測鞘氨醇單胞菌SC-1中3-PBA降解酶位于細胞膜上面，其可能是一類多亞基結(jié)構(gòu)酶。

3 討論與結(jié)論

圖5 回收蛋白條帶SDS-PAGE圖Fig.5 SDS-PAGE diagram of degrading 3-PBA by the protein recovered

(1)根據(jù)3-PBA的化學(xué)結(jié)構(gòu)推測，其降解酶可能是氧化酶中的一種。Shaohua等［16］檢測菌株(Bacillus sp.)降解3-PBA的產(chǎn)物時，發(fā)現(xiàn)3-(2-羥基苯氧基)苯甲酸在初期大量積累，之后經(jīng)過二芳基醚鍵的斷裂生成原兒茶酸、苯酚等，由此推斷菌株可產(chǎn)一種3-PBA氧化酶;Halden等［23］分離到1株產(chǎn)堿假單胞菌POB310，雖不能完全降解3-PBA，但能通過角雙加氧酶的作用使二苯醚鍵斷裂，生成苯酚和原兒茶酸。目前報道的大部分芳香族化合物氧化酶主要為胞內(nèi)酶［24］，也有部分位于細胞膜上，吳炬等［25］分離出的甲基單胞菌(Methylomonas sp.)具有較高的甲烷單加氧酶活性，且酶位于細胞膜上，可催化甲烷羥基化反應(yīng)生成甲醇;在真核生物中氧化酶主要分布于光滑內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上，也有部分位于細胞器的膜中［9］，而原核生物沒有細胞器，呼吸作用由細胞膜完成，其主要酶系也都分布于細胞膜上。這與本實驗得出的鞘氨醇單胞菌SC-1中3-PBA降解酶是一類膜蛋白吻合。本文首次提出了鞘氨醇單胞菌3-PBA降解酶位于細胞膜上，為3-PBA降解酶的進一步研究提供了理論基礎(chǔ)。

(2本實驗采用超聲波細胞破碎儀對分離得到的細胞膜進行處理，通過超聲過程中的空穴作用使細胞膜進一步破裂成碎片，使膜蛋白與細胞膜分離，通過Native-PAGE發(fā)現(xiàn)，膜蛋白可得到較好的分離，并具有一定的活性。

(3)本文對Native-PAGE中有降解活性的條帶c回收后進行SDS-PAGE分析，得到2條蛋白條帶，條帶蛋白所對應(yīng)分子質(zhì)量均較Dehmel等［22］從基因角度預(yù)測的分子質(zhì)量大，約為50～90 ku。根據(jù)降解酶分子質(zhì)量可初步推測出降解酶基因的大小，對3-PBA降解酶基因的研究及基因工程菌的構(gòu)建具有指導(dǎo)意義，段曉芹等［26］分析了菌株 Sphingobium fanise JZ-2降解3-苯氧基苯甲酸的代謝產(chǎn)物，其中有鄰苯二酚的生成，鄰苯二酚在鄰苯二酚1，2-雙加氧酶作用下開環(huán)，根據(jù)鄰苯二酚1，2-雙加氧酶基因序列設(shè)計兼并引物，成功地從JZ-2基因組擴增出鄰苯二酚1，2-雙加氧酶基因(catA);Zhang等［27］從菌株 Ralstonia eutropha JMP134擴增出降解3-苯氧基苯甲酸的基因mbhDHIM，最終獲得了可礦化3-苯氧基苯甲酸的工程菌。

(4)本文確定了鞘胺醇單胞菌的3-苯氧基苯甲酸降解酶的產(chǎn)生位于細胞膜上，該酶是一種膜蛋白，分子質(zhì)量約為50～90 ku。

［1］ 陳家長，吳偉，瞿建宏，等.溴氰菊酯脅迫下羅非魚組織中過氧化氫酶和單胺氧化酶的變化［J］.農(nóng)業(yè)環(huán)境科學(xué)學(xué)報，2006，25(6):1 441-1 445.

［2］ Helbling D E，Hollender J，Kohler H E，et al.Structurebased interpretation of biotransformation pathways of amidecontaining compounds in sludge-seeded bioreactors［J］.Environmental.Science and Technology，2010，44(17):6 628-6 635.

［3］ Nisha P，Meghna S，Surya T，et al.S100β upregulation:A possible mechanism of deltamethrin toxicity and motor coordination deficits［J］.Neurotoxicology and Teratology，2009，31(3):169-176.

［4］ Yang D F，Robin E P，Wang X L，et al.Human carboxylesterases HCEl and HCE2:Ontogenic expression，inter-individual variability and differential hydrolysis of oseltamivir，aspirin，deltamethrin and permethrin［J］.Biochemical Pharmacology，2009，77(2):238-247.

［5］ Jin M，Li L，Xu C，et al.Estrogenic activities of two synthetic pyrethroids and their metabolites［J］.Journal of Environmental Sciences，2010，22(2):290-296.

［6］ 李少南.農(nóng)藥對土壤生物群落的副作用的研究方法［J］.生態(tài)毒力學(xué)報，2010，5(2):18-24.

［7］ Yuan C，Wang C，Gao S Q，et al.Effects of permethrin，cypermethrin and 3-phenoxybenzoic acid on rat sperm motility in vitro evaluated with computer-assisted sperm analysis［J］.Toxicology in Vitro，2010，24(2):382-386.

［8］ 趙楠，劉書亮，賴文，等.HPLC-UV法測定微生物降解體系中3-苯氧基苯甲酸含量［J］.食品科學(xué)，2011，32(14):181-184.

［9］ Ji G X，Xia Y K，Gu A H，et al.Effects of non-occupational environmental exposure to pyrethroids on semen quality and sperm DNA integrity in Chinese men［J］.Reproductive Toxicology，2011，31(2):171-176.

［10］ 張錫輝.高等環(huán)境化學(xué)與微生物學(xué)原理及應(yīng)用［M］.北京:化學(xué)工業(yè)出版社，2001:50-70.

［11］ 虞云龍，陳鶴鑫，樊德方，等.Alcaligenes sp.YF11菌對殺滅菊酯的降解機理［J］.環(huán)境污染與防治，1998，6(20):5-7.

［12］ Mccarthy A R，Thomson B M，Shaw I C，et al.Estrogenicity of pyrethroid insecticide metabolites［J］.Journal of Environmental Monitoring，2006，8(1):197-202.

［13］ 虞云龍，盛國英，傅家饃.殺滅菊酯的微生物降解及酶促降解［J］.環(huán)境科學(xué)，1997，18(1):5-8.

［14］ Chen S H，Hu M Y，Yang L，et al.Biodegradation of beta-cypermethrin and 3-phenoxybenzoic acid by a novel Ochrobactrum lupini DG-S-01［J］.Journal of Hazardous Materials，2011，187(1-3):433-440.

［15］ ChenS H，Geng P，Xiao Y，et al.Bioremediation of βcypermethrin and 3-phenoxybenz-aldehyde contaminated soils using Streptomyces aureus HP-S-01［J］.Environmental Biotechnology，2012，94(2):505-515.

［16］ Chen S H，Hu W，Xiao Y，et al.Degradation of 3-phenoxybenzoic acid by a Bacillus sp.［J］.Plos One，2012，7(11):1-12.

［17］ Chen S H，Yang L，Hu M Y，et al.Biodegradation of fenvalerate and 3-phenoxybenzoic acid by a novel Stenotrophomonas sp.strain ZS-S-01 and its use in bioremediation of contaminated soils［J］.Environmental Biotechnology，2011，90(2):755-767.

［18］ 許育新，李曉慧，秦華，等.3-苯氧基苯甲酸降解菌的分離及降解特性研究［J］.微生物學(xué)通報，2005，32(5):62-66.

［19］ 邱吉國，鄭金偉，張雋，等.乙羧氟草醚降解菌Pseudomonas sp.YF1的分離、鑒定與降解特性［J］.應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報，2009，15(5):686～691.

［20］ Pattana P，Khanok R，Khin L K.Isolation and properties of cellulosome-type multienzyme complex of the thermophilic Bacteroides sp.strain P-1［J］.Enzyme and Microbial Technology，2000，26(5-6):459-465.

［21］ 陸健.蛋白質(zhì)純化技術(shù)及應(yīng)用［M］.北京:化學(xué)工業(yè)出版社，2005:181-202.

［22］ Dehmel U，Engesser K H，Timmis K N，et al.Cloning，nucleotide sequence，and expression of the gene encoding a novel dioxygenase involved in metabolism of carboxydiphenyl ethers in Pseudomonas pseudomas pseudoalcaligenes POB310［J］.Archives of Microbiology，1995，163(1):35-41.

［23］ Halden R U，Tepp S M，Halden B G，et al.Degradation of 3-phenoxybenzoic acid in soil by Pseudomonas pseudoalcaligenes POB310(pPOB)and two modified Pseudomonas strains［J］.Applied and Environmental Microbiology，1999，65(8):3 354-3 359.

［24］ 邱凌峰，吳芳芳，姚堯.苯酚降解菌TXl的分離鑒定及其降解特性［J］.上海環(huán)境科學(xué)，2010，29(1):35-40.

［25］ 吳炬，李永泉，馮建軍，等.甲基單胞菌Methylomonas sp.GYJ3的生長特性及產(chǎn)甲烷單加氧酶特性［J］.蘭州大學(xué)學(xué)報，2002，38(6):72-77.

［26］ 段曉芹，鄭金偉，張雋，等.3-PBA降解菌BA3的降解特性及基因工程菌構(gòu)建［J］.環(huán)境科學(xué)，2011，32(1):240-246.

［27］ Zhang J，Zheng J W，Liang B，et al.Biodegradation of chloroacetamide herbicides by Paracoccus sp.FLY-8 in vitro［J］.Journal of Agricultural Food Chemistry，2011，59(9):4 614-4 621.