簡(jiǎn)華君，李鵬鵬，黃小林，陳潔

(江南大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇無(wú)錫，214122)

大豆分離蛋白(SPI)具有良好的凝膠性、乳化性、持油持水性等功能性質(zhì)，因此被廣泛應(yīng)用于乳化香腸、火腿腸等肉制品中，以此提高產(chǎn)品質(zhì)構(gòu)和得率［1］。然而，關(guān)于添加SPI對(duì)肉制品影響的研究報(bào)道卻存在不一致性。例如，Matulis等人指出添加3%的商業(yè)SPI增強(qiáng)了乳化香腸的硬度［2］;Pietrasik等人發(fā)現(xiàn)2%的商業(yè)SPI提高了肉凝膠強(qiáng)度［3］;Chin等人發(fā)現(xiàn)，添加2.2%商業(yè)SPI不影響乳化香腸的凝膠強(qiáng)度，但添加量為4.4%時(shí)削弱了香腸質(zhì)構(gòu)［1］;然而，F(xiàn)oegeding等人認(rèn)為，大豆蛋白可能會(huì)對(duì)肉凝膠結(jié)構(gòu)起負(fù)面效應(yīng)［4］;McCord等人認(rèn)為，添加商業(yè)SPI降低了肌肉蛋白的凝膠強(qiáng)度［5］;Feng等人指出，未經(jīng)變性的native SPI對(duì)乳化香腸質(zhì)構(gòu)沒(méi)有影響，但經(jīng)熱處理和Alcalase水解后的SPI則提高了香腸硬度［6］?？梢酝茰y(cè)，以上不一致結(jié)果很可能是因?yàn)樗砑拥膎ative SPI、水解物和商業(yè)SPI結(jié)構(gòu)不同、所含組分也不同導(dǎo)致的。

商業(yè)SPI在工業(yè)生產(chǎn)過(guò)程中，通常會(huì)經(jīng)歷一定程度的變性和聚集，導(dǎo)致溶解度的降低，形成水不溶性的聚集體或沉淀［7-9］，同時(shí)也會(huì)形成一部分可溶性聚集體［10］。不同商業(yè)SPI的生產(chǎn)廠家由于工藝參數(shù)不同，可溶/不溶性聚集體比例不同，其產(chǎn)品的在肉制品中的應(yīng)用效果往往也不盡相同。另外，酶解作為一種常見(jiàn)的蛋白改性方法常被用于破壞蛋白結(jié)構(gòu)形成不同肽鏈片段，從而提高蛋白的功能性質(zhì)［11］。SPI的酶解物已被報(bào)道可以改善肉制品的風(fēng)味和保水性［12］。Feng等人曾報(bào)道SPI經(jīng)Alcalase酶解后的可溶和不溶性混合水解物能夠顯著提高香腸的硬度［6］。

本研究探討了SPI的可溶性水解物、可溶/不溶性聚集體對(duì)乳化香腸肉糜流變學(xué)性質(zhì)、香腸蒸煮得率、質(zhì)構(gòu)和微觀結(jié)構(gòu)的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

鮮豬后腿瘦肉、去皮豬肥膘，購(gòu)于大潤(rùn)發(fā)超市;腸衣為直徑2.2 cm的膠原蛋白腸衣，購(gòu)自淄博龍寶生物食品有限公司;商業(yè)SPI，益海嘉里秦皇島金海工業(yè)公司提供;Alcalase堿性蛋白酶，美國(guó)Novozymes公司;HCl和NaOH等，為分析純，購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;大豆、鹽、糖等為市售。

1.2 儀器

Avanti J-26 XP高速冷凍離心機(jī)，美國(guó)Beckman公司;SevenEasy pH計(jì)，瑞士梅特勒-托利多公司;0.45 μm微濾膜(Type HV)和100 kDa纖維素超濾膜，美國(guó)Millipore公司;BJRJ-12T臺(tái)式絞肉機(jī)，嘉興艾博不銹鋼機(jī)械工程有限公司;CM-14斬拌機(jī)，西班牙Mainca公司;TB-46灌腸機(jī)，永康市泰寶電器五金廠;Rational Selfcooking center 61E蒸烤箱，德國(guó)Rational公司;AR-G2流變儀，美國(guó) TA公司;TA-XT Plus質(zhì)構(gòu)儀，英國(guó) Stable Micro Systems公司;XL-30 ESEM環(huán)境掃描電鏡，荷蘭Philips公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 天然大豆分離蛋白(SPI)的制備

大豆首先去皮、粉碎、脫脂［m(豆粉)∶V(正已烷)∶V(乙醇)=3∶9∶1］得到脫脂豆粕。參考Ramirez-Suarez等［13］的“堿溶 -酸沉 -中和”方法提取SPI并冷凍干燥(視為native SPI)、研磨成粉末，真空包裝后保存在-20℃冰箱中。

1.3.2 SPI酶解物的制備

按1.3.1制備的native SPI用超純水配制成質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5.5%的溶液后，轉(zhuǎn)移至50℃循環(huán)水浴加熱的酶反應(yīng)器中，用0.1 mol/L的NaOH調(diào)節(jié)pH 8.0后，添加堿性蛋白酶Alcalase(酶活≥2.4 U/g，酶底比為1∶100)，同時(shí)滴加0.1 mol/L的NaOH維持pH值為8.0，直至蛋白水解度達(dá)到4%。根據(jù) pH-stat方法［14］計(jì)算達(dá)到目標(biāo)水解度時(shí)需消耗NaOH的體積。達(dá)到目標(biāo)水解度后，80℃水浴加熱15 min進(jìn)行滅酶處理，放入碎冰中冷卻后離心(10 000 g，15 min，4℃)取上清液調(diào)節(jié)pH 7.0并冷凍干燥(視為可溶性水解物)。

1.3.3 SPI可溶/不溶性聚集體的制備

商業(yè)SPI首先分散在超純水中，配成質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%的蛋白溶液，然后離心(10 000 g，15 min，4℃)。收集離心得到的沉淀，即為SPI的不溶性聚集體。離心得到的上清液首先通過(guò)0.45 μm的微濾膜去掉不溶性的蛋白大顆粒物質(zhì)，然后利用100 kDa的纖維素超濾膜，被濃縮截留下來(lái)的蛋白部分即為分子量超過(guò)100 kDa的部分。根據(jù)分子質(zhì)量分布測(cè)定可進(jìn)一步確定該部分為分子質(zhì)量大于1 000 kDa的可溶性聚集體。收集SPI可溶和不溶性聚集體分別冷凍干燥備用。將SPI可溶/不溶性聚集體干燥粉末按質(zhì)量1∶1混合得到SPI混合聚集體。

1.3.4 乳化香腸的制備

1.3.4.1 基礎(chǔ)配方［6］

純SPI為2%，先用部分水溶脹SPI粉末為12%溶液，剩下冰水量斬拌時(shí)添加。

1.3.4.2 工藝流程

表1 添加不同SPI的乳化香腸配方Table 1 Formulation of emulsified sausages containing different soy protein isolate

1.3.4.3 關(guān)鍵操作要點(diǎn)

腌制:將糖、鹽、等腌料和絞過(guò)的瘦肉攪拌均勻，在4℃下腌制24 h。

斬拌:將腌好的瘦肉和肥肉先斬拌3min，再添加預(yù)溶脹的不同SPI斬拌3min，用碎冰控制溫度在10℃以下。

蒸煮:灌制好的乳化香腸均勻地放在蒸烤箱中，將溫度探頭插入一根香腸的幾何中心。80℃加濕蒸煮至中心溫度達(dá)到72℃，再快速冷卻至室溫。

1.3.5 流變性質(zhì)

參考álvarez等人的方法［15］，利用流變儀在小幅振蕩模式下測(cè)定乳化肉糜的動(dòng)態(tài)彈性模量(G')變化。具體實(shí)驗(yàn)參數(shù)是:使用直徑為2 cm的平板夾具，對(duì)肉糜樣品進(jìn)行溫度掃描，以2℃/min的速率從20℃升至80℃，最大應(yīng)變?yōu)?.02，頻率為5 Hz，樣品厚度為1 mm。最后，在樣品和夾具邊緣滴加硅油，以便防止樣品的水分蒸發(fā)，并在夾具外面扣上保護(hù)蓋。

1.3.6 蒸煮得率

乳化香腸用膠原蛋白腸衣灌腸后(每隔10 cm用棉線打結(jié)為一根)編號(hào)稱重，蒸煮冷卻后再次按各編號(hào)分別稱重。每組樣品重復(fù)測(cè)定10根取平均值。

蒸煮得率/%=(香腸經(jīng)蒸煮后的質(zhì)量/蒸煮之前香腸的質(zhì)量)×100

1.3.7 全質(zhì)構(gòu)分析(TPA)

乳化香腸剝?nèi)ツc衣，切成2 cm高的圓柱體。使用質(zhì)構(gòu)儀進(jìn)行TPA分析，設(shè)定的主要參數(shù)是:探頭類型:P/36R;測(cè)前速度:3.0 mm/s;測(cè)定速度:3.0 mm/s;測(cè)后速度:5.0 mm/s;壓縮比:60%。每個(gè)樣品做10次平行，取平均值。記錄硬度、黏聚性和咀嚼性的測(cè)定結(jié)果。

1.3.8 微觀結(jié)構(gòu)

參考Plucknett等人［16］的方法，利用XL-30 ESEM環(huán)境掃描電鏡(ESEM)觀察乳化香腸的微觀結(jié)構(gòu)。從香腸內(nèi)部切出一小片厚度約為3 mm的樣品，用電鏡專用雙面膠粘貼在ESEM的圓形樣品臺(tái)上，再放入ESEM樣品室中，先抽真空再加壓。測(cè)試條件為:加速電壓20 kV，恒壓0.7 Torr，樣品室溫度8℃，放大倍數(shù)為800倍。樣品觀察時(shí)間控制在5 min以內(nèi)，以避免長(zhǎng)時(shí)間暴露導(dǎo)致樣品失水。

1.3.9 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析

本實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)如無(wú)特別說(shuō)明，均為2次重復(fù)3次平行獲得的平均值，使用origin 8.5作圖。使用Statistix 9的一般線性程序進(jìn)行方差分析，采用最小顯著差數(shù)法(LSD)對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性統(tǒng)計(jì)分析(P＜0.05)。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同類型SPI對(duì)乳化肉糜彈性模量的影響

分別添加了SPI可溶性水解物和可溶/不溶性聚集體的乳化肉糜，其彈性模量(G')隨溫度升高的變化如圖1所示。

圖1 大豆蛋白可溶性水解物和可溶/不溶性聚集體對(duì)乳化肉糜彈性模量的影響Fig.1 Effects of soluble hydrolysate and soluble/insoluble aggregates of soy protein isolate on the elastic modulus of meat emulsion

在20～40℃內(nèi)，所有肉糜樣品的G'值呈現(xiàn)出下降的趨勢(shì)，這可能是因?yàn)闇囟壬邥r(shí)，樣品內(nèi)部蛋白之間的氫鍵作用逐漸被破壞。所有樣品的G'值再上升至50℃達(dá)到峰值，下降到60℃達(dá)到最低值后，G'值迅速增加，表明肉糜狀態(tài)由黏性溶膠向彈性凝膠網(wǎng)絡(luò)轉(zhuǎn)變。乳化肉糜的這種流變性質(zhì)模式與已經(jīng)報(bào)道的肌纖維蛋白凝膠和乳化型凝膠相吻合［15，17-18］。與未添加任何SPI的空白肉糜相比，添加SPI的不溶性聚集體和混合可溶/不溶性聚集體都很顯著地提高了肉糜的彈性模量(P＜0.05)，而單獨(dú)添加SPI的可溶性聚集體對(duì)肉糜沒(méi)有明顯的影響。添加未變性native SPI肉糜的G'值低于未添加SPI的空白肉糜，這一結(jié)果與native SPI在肌肉蛋白中的負(fù)面效果一致。添加SPI酶解物也顯著破壞了肉糜的凝膠網(wǎng)絡(luò)形成。

2.2 不同類型SPI對(duì)乳化香腸蒸煮得率的影響

如圖2所示，與空白香腸相比，添加不同類型的SPI(native，酶解物和聚集體)都顯著提高了香腸的蒸煮得率。其中，含有SPI不溶性聚集體的香腸蒸煮得率最高，比不添加任何SPI的空白香腸蒸煮得率高了4%(P＜0.05)。這可能是因?yàn)椴蝗苄跃奂w的添加起到一定的空間填充效應(yīng)，使香腸結(jié)構(gòu)變得更致密，空隙變少，提高了連續(xù)相中的有效蛋白濃度，從而增強(qiáng)了蛋白的保水量［19］。此外，這種由不溶性聚集體誘導(dǎo)形成的香腸致密結(jié)構(gòu)也可能起到一定的鎖水作用，在蒸煮過(guò)程中對(duì)香腸內(nèi)部的水分蒸發(fā)起到物理阻礙的屏障效應(yīng)。另外，SPI的酶解物也提高了香腸的蒸煮得率，這是因?yàn)橛邢匏饽軌虼偈勾蠖沟鞍椎奶烊痪o湊結(jié)構(gòu)解離，形成亞基和帶電極性基團(tuán)(NH3+，

COO-)，從而增強(qiáng)蛋白的束水能力［6，11］。

圖2 大豆蛋白可溶性水解物和可溶/不溶性聚集體對(duì)乳化香腸蒸煮得率的影響Fig.2 Effects of soluble hydrolysate and soluble/insoluble aggregates of soy protein isolate on the cooking yield of emulsified sausage

2.3 不同類型SPI對(duì)乳化香腸質(zhì)構(gòu)的影響

添加不同類型SPI對(duì)香腸質(zhì)構(gòu)的影響如表2所示。與不添加任何SPI的空白香腸相比，添加SPI不溶性聚集體的香腸硬度、黏聚性和咀嚼性均顯著提高(P＜0.05)。添加SPI可溶性聚集體和native SPI對(duì)香腸質(zhì)構(gòu)都沒(méi)有明顯影響，但SPI水解物則顯著破壞了香腸的質(zhì)構(gòu)。結(jié)合香腸的微觀結(jié)構(gòu)可以看出，SPI的不溶性聚集體至少部分以“填充物”的形式分布在香腸的蛋白網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)中，香腸結(jié)構(gòu)緊密，并改善了香腸的質(zhì)構(gòu)。SPI不溶性聚集體的這種“填充物”效應(yīng)提高香腸質(zhì)構(gòu)的情況類似于脂肪球增強(qiáng)肌肉蛋白凝膠強(qiáng)度［19］。

值得一提的是，F(xiàn)eng等人曾經(jīng)報(bào)道添加SPI的Alcalase水解物(DH4)顯著提高了乳化香腸的質(zhì)構(gòu)［6］，而本研究卻發(fā)現(xiàn)，SPI經(jīng)Alcalase水解后顯著削弱了香腸的質(zhì)構(gòu)。分析產(chǎn)生2種截然相反結(jié)果的原因，很有可能是源自二者添加的SPI水解物成分的極大差異。Feng等人是將SPI的水解物全部添加到香腸中，其中包括經(jīng)水解產(chǎn)生的可溶部分的多肽段和發(fā)生疏水聚集的不溶性沉淀;而本研究是將SPI的水解物離心后，僅取其可溶部分添加到香腸中。該可溶性的多肽段很可能破壞瓦解肌肉蛋白凝膠網(wǎng)絡(luò)的形成，從而在宏觀上表現(xiàn)出質(zhì)構(gòu)比不添加任何SPI的空白香腸差。同時(shí)，根據(jù)該SPI水解物組分差異引起的相反結(jié)果，似乎也可以從側(cè)面幫助推測(cè)出SPI的不溶性聚集體或沉淀物具有改善香腸質(zhì)構(gòu)的有利作用。

表2 大豆蛋白可溶性水解物和可溶/不溶性聚集體對(duì)乳化香腸質(zhì)構(gòu)的影響Table 2 Effects of soluble hydrolysate and soluble/insoluble aggregates of soy protein isolate on the texture of emulsified sausage

2.4 不同類型SPI對(duì)乳化香腸微觀結(jié)構(gòu)的影響

利用環(huán)境掃描電鏡(ESEM)觀察了添加不同SPI對(duì)香腸微觀結(jié)構(gòu)的影響，如圖3所示。與傳統(tǒng)掃描電鏡(SEM)相比，環(huán)境掃描電鏡無(wú)需干燥、噴金等前處理，可以直接觀察含水樣品在原始狀態(tài)下的微觀結(jié)構(gòu)，比如 β-乳球蛋白［20］、明膠/糊精混合凝膠［21］。從圖3可以看出，未添加任何SPI的香腸呈現(xiàn)出具有纖維狀、棒狀、多孔的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，這與Feng等人使用普通掃描電鏡(SEM)觀察到的空白香腸結(jié)構(gòu)一致［6］。添加native SPI的香腸結(jié)構(gòu)較粗糙、空隙較大。添加SPI水解物的香腸看上去比較松散細(xì)碎，缺少了連續(xù)的繩狀交聯(lián)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，這可能是因?yàn)镾PI經(jīng)水解后形成的小分子多肽段干擾了肌肉蛋白相互間的交聯(lián)反應(yīng)。添加SPI的可溶性聚集體后，可以看到香腸的凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)密度增強(qiáng)，空隙變小。而添加的SPI不溶性聚集體似乎像填充物一樣，使得香腸結(jié)構(gòu)更連續(xù)緊實(shí)，空隙較少，這種更緊密的交互式結(jié)構(gòu)很可能有利于提高香腸蒸煮得率和質(zhì)構(gòu)。

圖3 大豆蛋白可溶性水解物和可溶/不溶性聚集體對(duì)乳化香腸微觀結(jié)構(gòu)的影響(ESEM，放大倍數(shù)800)Fig.3 Effects of soluble hydrolysate and soluble/insoluble aggregates of soy protein isolate on the microstructure of emulsified sausage(ESEM，magnification:×800)

3 結(jié)論

與不添加任何SPI的空白香腸相比，添加native SPI、SPI的可溶性水解物和可溶/不溶性聚集體均顯著提高了乳化香腸的蒸煮得率。native SPI較明顯地降低了肉糜的彈性模量，但對(duì)香腸的質(zhì)構(gòu)沒(méi)有明顯影響;SPI的可溶性水解物顯著地破壞了香腸的質(zhì)構(gòu)和凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu);SPI的可溶性聚集體對(duì)乳化肉糜的彈性模量和香腸質(zhì)構(gòu)沒(méi)有明顯影響，但在一定程度上改善了香腸的微觀結(jié)構(gòu);SPI的不溶性聚集體很顯著地提高了肉糜彈性模量和香腸質(zhì)構(gòu)，并誘導(dǎo)形成了較連續(xù)緊密的香腸結(jié)構(gòu)。本研究結(jié)果說(shuō)明了商業(yè)SPI中的不溶性聚集體部分對(duì)香腸品質(zhì)的改善作用，對(duì)乳化香腸用商業(yè)SPI的生產(chǎn)具有一定的指導(dǎo)意義。

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