尚朝杰，王維民，諶素華，張曉迪，徐玉娟

1(廣東海洋大學(xué)食品科技學(xué)院，廣東湛江，524088)

2(廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶業(yè)與農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，廣東廣州，510610)

芒果是世界五大水果之一，它肉質(zhì)細(xì)嫩、香甜，營養(yǎng)豐富，素有“熱帶水果之王”的美稱，深受人們的喜愛。我國芒果產(chǎn)量豐富，是世界第二大芒果生產(chǎn)國，2010年種植面積達(dá) 12.90 萬 hm2，總產(chǎn)量 90.64 萬t［1］。但芒果采收期短、貯運困難、損耗大，因此，芒果除作鮮果食用外，約有85%芒果加工成為芒果汁、芒果原漿和芒果罐頭等。

果汁在加工和貯藏過程中，會發(fā)生褐變，不僅影響果汁的外觀、風(fēng)味，而且還會造成營養(yǎng)物質(zhì)的丟失，甚至果汁的變質(zhì)。傳統(tǒng)的亞硫酸鹽能很好地抑制褐變，但安全性存在風(fēng)險，美國FDA已于1986年限制了它在果蔬中的使用［2］。抗壞血酸也可用于抑制褐變，但其抗褐變效果有濃度依賴性，添加量少，作用不明顯，添加量多，會導(dǎo)致非酶褐變［3］。因此研究和開發(fā)更加安全有效的褐變抑制劑很有必要。

目前果汁褐變的研究主要集中在蘋果、梨、藍(lán)莓等，對芒果果汁的褐變研究較少。芒果帶皮生產(chǎn)果汁可以提高芒果的利用率，減少果皮資源浪費，降低果汁生產(chǎn)成本，但果皮的加入，使得果汁中總酚含量增加，果汁更易褐變，因而防止褐變是芒果帶皮果汁生產(chǎn)的關(guān)鍵。本文通過添加D-異抗壞血酸鈉、L-半胱氨酸［4-5］、植酸［6］等5種褐變抑制劑對酶法生產(chǎn)芒果帶皮果汁的褐變情況進行研究，利用響應(yīng)面法優(yōu)化出最佳的復(fù)合褐變抑制劑。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

金煌芒芒果(九成熟)，購自廣東湛江水果市場;果膠酶(酶活力10萬U/g)和纖維素酶(酶活力10萬U/g)，和氏璧生物技術(shù)有限公司;D-異抗壞血酸鈉(食品級)，河北百味生物科技有限公司;L-半胱氨酸(食品級)，河南金潤食品添加劑有限公司;植酸(食品級)，桐鄉(xiāng)鑫洋食品添加劑有限公司;CaCl2和NaCl(食品級)，連云港冠蘇實業(yè)有限公司。

1.2 儀器和設(shè)備

UX420H、AUW120型電子天平，日本島津;DH2230型打漿機，蒙達(dá)電器有限公司;HHS型電熱恒溫水浴鍋，上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠;TDZ5-WS臺式低速離心機，湖南赫西儀器裝備有限公司;722S可見分光光度計，上海精密科學(xué)儀器有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 果汁生產(chǎn)工藝流程

1.3.2 果汁褐變程度的測定

實驗方法參考許鵬麗［7］并改進。果汁褐變產(chǎn)生的色素在420 nm處有較大吸收，因此可用分光光度計測果汁420 nm處的吸光度來反應(yīng)褐變度［8］。將制得的果汁置于250 mL燒杯后，稱取一定量的果汁，4 000 r/min離心10 min，取上清液在420 nm處測定吸光度(A0)，剩余果汁開口置于室溫下充分氧化褐變，24 h后再測其吸光度(A24)，每個試樣重復(fù)3次，取平均值。計算2次吸光度之差(△A)再由△A計算出褐變變化率，用以表示褐變程度，△A%值越小，抑制褐變的作用越大。

1.3.3 抑制劑最佳添加時間的確定

在酶法生產(chǎn)芒果果汁過程中，破碎、酶解，滅酶、冷卻這4個階段都有可能引起果汁的褐變，因此分別在破碎前、酶解前、滅酶前和冷卻前4個階段加入0.3%的L-半胱氨酸，壓榨過濾取汁，測定果汁的褐變度，空白組不加抑制劑，其他操作相同，找出褐變抑制劑的最佳添加時間。

1.3.4 實驗設(shè)計

以褐變變化率為指標(biāo)，在最佳添加時間下選取D-異抗壞血酸鈉(0、0.02%、0.04%、0.06%、0.08%、0.10%)、L-半胱氨酸 (0、0.03%、0.06%、0.09%、0.12%、0.15%)、植 酸 (0、0.004%、0.008%、0.012%、0.016%、0.02%)、NaCl(0、0.02%、0.04%、0.06%、0.08%、0.10%)、CaCl2(0、0.02%、0.04%、0.06%、0.08%、0.10%)進行單因素試驗，考察 5 種褐變抑制劑對芒果果汁的褐變抑制效果。

不同的褐變抑制劑抑制褐變的機制不同，而單一的褐變抑制劑難取得好的抑制效果。因此根據(jù)單因素的實驗結(jié)果，選取D-異抗壞血酸鈉、L-半胱氨酸、植酸3種效果較好的褐變抑制劑進行復(fù)合抑制劑的優(yōu)化。利用 Design-Expert 8.0軟件中 Box-Behnken試驗設(shè)計原理，設(shè)計3因素3水平的Box-Behnken中心組合實驗，實驗因素與水平見表1，利用Design-expert 8.0軟件進行響應(yīng)面分析，確定最優(yōu)復(fù)合抑制劑。

表1 Box-Behnken實驗設(shè)計因素與水平Table 1 Factors and levels of experimental design for Box-Behnken

1.3.5 數(shù)據(jù)處理方法

單因素實驗結(jié)果采用Origin8.5軟件進行作圖，響應(yīng)面實驗結(jié)果采用Design-expert 8.0軟件進行分析處理。每個實驗重復(fù)3次，數(shù)據(jù)用“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同添加時間的果汁褐變度結(jié)果與分析

由圖1可以看出，4個階段添加褐變抑制劑都對果汁褐變都有一定的抑制效果，且添加時間越晚果汁褐變度越大，褐變越嚴(yán)重，其中破碎前添加褐變抑制效果最好，冷卻前添加褐變抑制效果最差。對比破碎前加入和酶解前加入可知，果汁褐變度相差很小，這是由于在實驗過程中，破碎階段時間較短，期間發(fā)生酶促褐變程度較小。對比滅酶前加入和冷卻前加入可知，果汁褐變度相差也較小，這是由于滅酶階段時間短，溫度高，從而褐變相對較小。對比酶解前加入和滅酶前加入可知，果汁褐變度變化較大，這是由于酶解階段時間較長，酶解溫度(40.6℃)與芒果多酚氧化酶最適溫度［9］(50℃)比較接近，有利酶促褐變的發(fā)生。綜合實驗操作方便和褐變抑制效果，選取酶解前為褐變抑制劑最佳添加時間。

圖1 不同添加時間的果汁褐變度Fig.1 The browning degree of juice in different adding time

2.2 單因素實驗結(jié)果與分析

L-半胱氨酸是一種可溶性氨基酸，本身含有氨基、羧基，又含有巰基(—SH)，能與酶促褐變中間產(chǎn)物醌形成穩(wěn)定的無色化合物，從而抑制褐變［10］。由圖2可以看出，酶解前加入L-半胱氨酸對果汁的褐變變化率影響較明顯，當(dāng)用量在0.09%之前時，褐變變化率隨用量的增加而迅速減小，用量超過0.09%后，褐變變化率變化不明顯，基本保持不變，說明0.09%的L-半胱氨酸用量抑制褐變效果較好。

D-異抗壞血酸鈉在酸性條件下可形成異抗壞血酸，異抗壞血酸與抗壞血酸互為旋光異構(gòu)體，一樣具有還原性，能將有色物質(zhì)鄰二醌還原成無色物質(zhì)鄰二酸，從而起到抑制褐變的作用［11］。由圖3可知，D-異抗壞血酸鈉可較明顯的降低褐變變化率，抑制褐變。當(dāng)用量為0.06%時，褐變變化率最小，0.06%之前時隨用量的增加，褐變變化率逐漸減小，0.06%之后褐變變化率略微有些變化，總體基本不變，說明0.06%的D-異抗壞血酸鈉用量抑制褐變效果較好。

圖2 L-半胱氨酸用量對芒果果汁褐變變化率的影響Fig.2 Effects of L-Cys dosage on change rate of mango juice browning

圖3 D-異抗壞血酸鈉用量對芒果果汁褐變變化率的影響Fig.3 Effects of sodium D-isoascorbate dosage on change rate of mango juice browning

植酸也叫肌醇六磷酸，具有很強的螯合能力，且在很寬的pH范圍內(nèi)都很穩(wěn)定，它可以鰲合PPO中的銅輔基，并具有很強的抗氧化能力，從而抑制褐變［12］。由圖4可知，植酸可降低果汁褐變變化率，抑制褐變。隨著植酸用量的增加，果汁的褐變變化率呈逐漸減小的趨勢，當(dāng)植酸達(dá)到最大允許添加量0.020%時，褐變變化率最小。為方便做響應(yīng)面優(yōu)化，選取0.016%為植酸最優(yōu)用量。

圖4 植酸用量對芒果果汁褐變變化率的影響Fig.4 Effects of phytic acid dosage on change rate of mango juice browning

NaCl一定程度上可降低水溶液中的氧含量，使酚類物質(zhì)難與氧氣接觸，且Na+與多酚氧化酶中Cu2+競爭，從而降低多酚氧化酶活性，抑制褐變［13］。由圖5可以看出，氯化鈉用量對芒果果汁的褐變影響很小，隨著用量的增加褐變變化率幾乎沒什么變化，說明氯化鈉對芒果果汁褐變抑制不明顯。

圖5 NaCl用量對芒果果汁褐變變化率的影響Fig.5 Effects of NaCl dosage on change rate of mango juice browning

CaCl2對褐變的抑制作用有2個解釋，一是鈣與氨基酸結(jié)合成為不溶性化合物，因此鈣鹽有協(xié)同SO2控制褐變的作用;二是Ca2+與PPO中的Cu2+的競爭，從而抑制褐變［14］。由圖6可知，CaCl2用量對芒果果汁褐變影響很小，隨著用量的增加，褐變變化率變化較小，說明CaCl2對芒果果汁褐變抑制不明顯。

圖6 CaCl2用量對芒果果汁褐變變化率的影響Fig.6 Effects of CaCl2dosage on change rate of mango juice browning

2.3 響應(yīng)面實驗結(jié)果與分析

2.3.1 回歸模型的建立與分析

響應(yīng)面設(shè)計與分析結(jié)果見表2。利用軟件Design-expert 8.0 進行 D-異抗壞血酸鈉用量(A)、L-半胱氨酸用量(B)、植酸用量(C)3個因素對褐變變化率(Y)影響的多元回歸擬合分析，建立二次多項式回歸方程為:

表2 響應(yīng)面設(shè)計及實驗結(jié)果Table 2 The Box-Behnken design and experimental results

從表3可知，回歸模型(P＜0.01)極顯著，失擬項(P ＞0.05)不顯著，且 R2=0.971 1，擬合程度 ＞0.90，說明預(yù)測值與實驗值具有高度相關(guān)性，模型能反應(yīng)響應(yīng)值的變化，可用該模型對芒果果汁的褐變變化率進行很好的分析和預(yù)測。由表3還可看出，因素B、C2對芒果果汁褐變變化率影響極顯著(P＜0.01)，因素 A、C、AB、AC 對芒果果汁褐變變化率影響顯著(P ＜0.05)，因素 BC、A2、B2對芒果果汁褐變變化率影響不顯著(P＞0.05)。由各因素均方值可知，各因素對果汁褐變變化率的影響順序為:L-半胱氨酸＞D-異抗壞血酸鈉＞植酸。

表3 回歸系數(shù)顯著性Table 3 The significance test of regression coefficients

2.3.2 響應(yīng)面等高線和響應(yīng)曲面圖分析

等高線的形狀反映交互作用的強弱大小，圓形表示兩因素交互作用不顯著，而橢圓形則與之相反［15］。從圖7-a可以看出，當(dāng)植酸用量為0.016%時，L-半胱氨酸用量和D-異抗壞血酸鈉用量對芒果果汁褐變變化率的交互作用較顯著。D-異抗壞血酸鈉用量在0.04% ～0.08%時，隨L-半胱氨酸用量的增加褐變變化率逐漸增加，且當(dāng)用量處于高水平時褐變變化率增加趨勢不明顯。L-半胱氨酸用量在0.06% ～0.12%范圍時，隨D-異抗壞血酸鈉用量的增加，褐變變化率小幅上升，變化趨勢不明顯。由圖7-b可以看出，當(dāng)L-半胱氨酸用量為0.09%時，D-異抗壞血酸鈉用量和植酸用量對芒果果汁褐變變化率的交互作用較顯著。植酸用量在0.012% ～0.020%時，隨 D-異抗壞血酸鈉用量的增加，褐變變化率先下降后趨于穩(wěn)定。D-異抗壞血酸鈉用量在0.04% ～0.08%范圍時，隨植酸用量的增加，褐變變化率先下降后略微上升。圖7-c表明，當(dāng)D-異抗壞血酸鈉用量0.06%時，植酸用量和L-半胱氨酸用量對芒果果汁褐變變化率的交互作用不顯著。植酸用量在0.012% ～0.020%時，隨L-半胱氨酸用量的增加，褐變變化率呈逐漸增加趨勢。L-半胱氨酸用量在0.06% ～0.12%時，隨植酸用量的增加，褐變變化率呈先下降后上升趨勢。

圖7 D-異抗壞血酸鈉、L-半胱氨酸、植酸的交互作用對褐變變化率影響的等高線和響應(yīng)曲面圖Fig.7 Response surface and contour plots for the interaction effect of sodium D-isoascorbate，L-Cys and phytic acid on change rate of browning

2.3.3 最佳復(fù)合褐變抑制劑的確定和驗證實驗

根據(jù)Box-Behnken實驗所得數(shù)據(jù)，利用Design-Expert8.0軟件處理，可得芒果褐變最佳復(fù)合抑制劑為:D-異抗壞血酸鈉用量為0.047%，L-半胱氨酸用量為0.060%，植酸用量為0.017%，在此條件下預(yù)測的褐變變化率為11.91%。為了檢驗響應(yīng)面法的可行性，用所得的最佳條件進行驗證性實驗，通過3組平行實驗得到的褐變變化率為(12.19±0.14)%，與預(yù)測值11.91%吻合率達(dá)到97.70%。因此，采用響應(yīng)面法法優(yōu)化得到的最佳褐變復(fù)合抑制劑用量準(zhǔn)確可靠，具有實際參考價值。

3 結(jié)論

通過破碎前、酶解前、滅酶前和冷卻前4個階段添加褐變抑制劑，得到酶解法生產(chǎn)芒果果汁褐變抑制劑的最佳添加時間為酶解前。褐變抑制劑D-異抗壞血酸鈉，L-半胱氨酸和植酸對芒果果汁褐變抑制效果較好，NaCl和CaCl2對芒果果汁褐變基本無抑制效果。

采用響應(yīng)面法對芒果果汁褐變復(fù)合抑制劑進行優(yōu)化，得到最佳的復(fù)合抑制劑為D-異抗壞血酸鈉用量 0.047%，L-半胱氨酸用量 0.06%，植酸用量0.017%，在此條件下果汁的褐變變化率為12.19%，與預(yù)測值11.91%吻合率達(dá)到97.70%，說明實驗結(jié)果與模型擬合性較好，優(yōu)化后的復(fù)合抑制劑合理可行，對以后芒果果汁工業(yè)生產(chǎn)控制褐變具有較好的指導(dǎo)意義。

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