王偉，張永進(jìn)，蔣中輝，顧正芬，劉瑋，葉川，林琳，姜紹通，陸劍鋒

1(合肥工業(yè)大學(xué)生物與食品工程學(xué)院，安徽合肥，230009)2(淮南市焦崗湖忠輝食品有限公司，安徽淮南，232180)

豆豉是我國(guó)傳統(tǒng)的發(fā)酵食品，它是以大豆為主要原料，經(jīng)過(guò)微生物發(fā)酵而制成的豆制品，具有風(fēng)味獨(dú)特、營(yíng)養(yǎng)豐富、含有多種生理活性物質(zhì)等特點(diǎn)，屬于高營(yíng)養(yǎng)的植物性食品［1-3］。豆豉品種按制曲時(shí)參與的微生物不同，分為毛霉型、曲霉型、根霉型和細(xì)菌型等4種類型［4］。神仙豆是皖北地區(qū)民間發(fā)酵的一種特色豆豉制品，經(jīng)過(guò)精選-浸泡-蒸煮-發(fā)酵-成熟-炒制等傳統(tǒng)工藝制備得到。早期的研究表明，神仙豆屬于細(xì)菌型豆豉制品［5］。

不同發(fā)酵類型的豆豉產(chǎn)生的風(fēng)味物質(zhì)不同［4］。秦禮康等［6］對(duì)傳統(tǒng)陳窖豆豉粑和霉菌型豆豉揮發(fā)性風(fēng)味化合物進(jìn)行了研究，共鑒定出揮發(fā)性化合物102種，發(fā)現(xiàn)Maillard反應(yīng)產(chǎn)物(尤其是吡嗪)對(duì)產(chǎn)品特征風(fēng)味的形成起著非常重要的作用;范琳等［7］對(duì)曲霉型豆豉后發(fā)酵過(guò)程中不同時(shí)期的揮發(fā)性成分進(jìn)行了分析，認(rèn)為 1-辛烯-3-醇、3-甲基丁醇、2-甲基丁酸乙酯、己酸乙酯、苯乙醛、3-乙氧基丙烯、4-羥基2-丁酮、4-甲基吡嗪和2-甲基-丙酸乙酯為豆豉整個(gè)后發(fā)酵過(guò)程中主要的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì);Feng等［8］對(duì)少孢根霉發(fā)酵型豆豉揮發(fā)性風(fēng)味化合物進(jìn)行了研究，結(jié)果表明，其揮發(fā)性化合物乙醇、丙酮、2-丁酮、3-甲基-1-丁醇占主導(dǎo)地位;余愛(ài)農(nóng)等［9］采用干餾提取法對(duì)湖北地區(qū)的細(xì)菌型豆豉的香味成分進(jìn)行了研究，共鑒定出27種揮發(fā)性化合物，其中關(guān)鍵香味化合物有月桂醛、12-羥基-7α-桉葉-4-烯-6-酮、月桂醇等13種。但是皖北地區(qū)傳統(tǒng)發(fā)酵豆豉——神仙豆，其基本營(yíng)養(yǎng)和香氣成分的研究尚屬空白。

近年來(lái)，頂空固相微萃取(HS-SPME)和氣質(zhì)聯(lián)用(GC-MS)方法常被用于鑒定食品中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)。鑒于此，本研究采用HS-SPME和GC-MS首次分析和鑒定了神仙豆的揮發(fā)性主體風(fēng)味化合物，同時(shí)測(cè)定了神仙豆的基本成分和游離氨基酸，并初步探討了神仙豆產(chǎn)品風(fēng)味組成與感官特性的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

神仙豆，取自安徽淮南市焦崗湖忠輝食品有限公司，其豆豉原料采用傳統(tǒng)工藝發(fā)酵，發(fā)酵成熟后進(jìn)行加料炒制，并采用真空包裝上市。樣品帶回實(shí)驗(yàn)室后在4℃保藏直至使用。C7～C40正構(gòu)烷烴混合物標(biāo)品(1 000 μg/mL，溶于正己烷)，美國(guó) Sigma公司。試驗(yàn)中采用檢測(cè)試劑均為分析純。

1.2 主要儀器與設(shè)備

日立L-8900全自動(dòng)氨基酸分析儀，日本Hitachi公司;QP-2010氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，日本島津公司;萃取頭DVB/CAR/PDMS50/30 μm(二乙烯基苯/碳分子篩/聚二甲基硅氧烷)、SPME手動(dòng)進(jìn)樣其器，美國(guó)Supelco公司;DB-5MS毛細(xì)管色譜柱，美國(guó)Agilent公司;15 mLEPA/VOA螺口樣品瓶，美國(guó)Super-Tech公司;CT15RT臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)，上海天美科學(xué)儀器有限公司;Hanon K9840自動(dòng)凱氏定氮儀，濟(jì)南海能儀器有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 基本營(yíng)養(yǎng)成分測(cè)定

水分含量的測(cè)定采用直接干燥法(GB5009.3-2010);粗蛋白含量的測(cè)定采用凱氏定氮法(GB5009.5-2010);粗脂肪含量的測(cè)定采用索氏抽提法(GB5009.6-2003);灰分含量的測(cè)定采用干法灰化法(GB5009.4-2010);粗纖維含量的測(cè)定采用重量法(GB5009.10-2003);總糖含量的測(cè)定采用比色法(GB15672-2009)。

1.3.2 游離氨基酸的測(cè)定

將樣品研磨后，用4%的磺基水楊酸定容，振蕩混勻，靜置1 h，12 000 g 離心，10 min，吸取上清液，最后上清液用孔徑為0.22 μm濾膜抽濾，濾液備用。采用氨基酸全自動(dòng)分析儀測(cè)定。

1.3.3 頂空固相萃取法

取4 g神仙豆樣品，迅速加入15 mL螺口樣品瓶中，加蓋密封墊和鋁帽，置于60℃水浴鍋中，加熱平衡15 min后，通過(guò)密封墊插入已活化好的SPME萃取頭，推出纖維頭，頂空吸附30 min后，插入氣相色譜進(jìn)樣口解析3 min。

1.3.4 分析條件

萃取頭的活化:在使用萃取頭之前，必須進(jìn)行活化。將50/30 μm(DVB/CAR/PDMS)萃取頭于 270℃活化1 h，活化至無(wú)干擾峰出現(xiàn)。

色譜條件:色譜柱為DB-5MS(30 m×0.25 mm，0.25 μm);載氣:氦氣;柱流量:1 mL/min;進(jìn)樣口溫度:250℃，不分流進(jìn)樣;起始溫度為40℃，保持2 min，以6℃/min升至120℃，保持5 min，以8℃/min升至200℃，保持2 min，再以10℃/min升至250℃，保持8 min。

質(zhì)譜條件:接口溫度250℃;離子源溫度230℃;四級(jí)桿溫度150℃;電離方式:EI;電子能量:70 eV;質(zhì)量掃描范圍45～450 amu/s。

1.3.5 正構(gòu)烷烴保留時(shí)間的確定

將C7～C40正構(gòu)烷烴混合物標(biāo)品在上述GC-MS條件下進(jìn)行分析，得到C7～C40正構(gòu)烷烴的保留時(shí)間，用于計(jì)算保留指數(shù)［10］。

1.3.6 化合物鑒定及定量

未知化合物經(jīng)計(jì)算機(jī)檢索，同時(shí)與NIST library(107k compounds)和 Wiley Library(320k compounds，version6.0)相匹配。當(dāng)匹配度和純度大于800(最大值1 000)，計(jì)算分離出的揮發(fā)性組分的保留指數(shù)，并與相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道的該組分的保留指數(shù)進(jìn)行對(duì)比。按峰面積歸一化法計(jì)算化合物相對(duì)百分含量。

2 結(jié)果與討論

2.1 神仙豆的基本營(yíng)養(yǎng)成分

由表1可知，神仙豆的水分含量約53.78%，粗蛋白含量約15.37%，粗脂肪含量約15.62%，總糖含量約8.55%，粗纖維含量約2.66%，灰分含量約3.59%。結(jié)果表明，神仙豆的基本成分含量和納豆非常接近，如粗蛋白含量約15% ～16%、粗纖維含量約2% ～3%［11］，但其粗脂肪含量略微偏高，可能是由于神仙豆加工過(guò)程中添加植物油混合炒制的緣故。由此可見(jiàn)，神仙豆與我國(guó)其他傳統(tǒng)發(fā)酵豆制品相似，同樣也具有較高的營(yíng)養(yǎng)和食用價(jià)值。

表1 神仙豆的基本營(yíng)養(yǎng)成分含量(%，以濕重計(jì))Table 1 Contents of basic nutrition components in Shenxian bean(%，wet weight)

2.2 游離氨基酸的組成及含量

氨基酸是重要的呈味物質(zhì)，特別是游離氨基酸對(duì)于神仙豆的獨(dú)特風(fēng)味的形成密切相關(guān)。由表2可知，神仙豆的游離氨基酸總量為(4.70±0.07)mg/g，谷氨酸含量最高，占游離氨基酸總量的58.08%。此外，食物的鮮美在一定程度上取決于致鮮氨基酸(Glu、Asp、Gly、Ala)的組成和含量。由表3可知，神仙豆的游離致鮮氨基酸含量為2.91 mg/g，占游離氨基酸總量的61.78%，谷氨酸占游離致鮮氨基酸總量的93.81%，而其他3種氨基酸含量則相對(duì)較低。但總體上來(lái)說(shuō)，神仙豆具有較強(qiáng)的鮮味口感。

2.3 神仙豆的揮發(fā)性成分分析

2.3.1 神仙豆的揮發(fā)性成分總離子流色譜圖

圖1為神仙豆揮發(fā)性成分總離子流色譜圖。由圖1可知，采用HS-SPME和GC-MS方法得到的神仙豆揮發(fā)性組分的分離效果和出峰圖譜較好，適用于本文后續(xù)的揮發(fā)性成分分析鑒定。

2.3.2 神仙豆的揮發(fā)性成分種類數(shù)

由表4可知，在神仙豆中鑒定出9類揮發(fā)性化合物，共72種，包括醇類(16種)、含氮類(8種)、酯類(2種)、醛類(14 種)、烴類(18種)、酮類(4種)、酸類(3種)、酚類(4種)、醚類(3種)。從種類上看，醚類化合物、醇類化合物、含氮化合物、醛類的相對(duì)含量較豐富，而烴類、酮類、酚類、酸類、酯類的相對(duì)含量較低。而從成分上看，茴香腦、3-羥基-2-丁酮、2，3-丁二醇在神仙豆中的相對(duì)含量均較高。此外，2，5-二甲基吡嗪、2，3，5-三甲基吡嗪、2，3，5，6-四甲基吡嗪、乙酸芳樟酯、2，4-癸二烯醛、丁香酚、芳樟醇、3-甲基丁酸、2-甲基丁酸、十六碳醛、檸檬烯、1-石竹烯、甲苯等的相對(duì)含量也較高。

表2 神仙豆的游離氨基酸組成Table 2 Compositions of free amino acids in Shenxian bean

圖1 神仙豆揮發(fā)性成分總離子色譜圖Fig.1 Total ion chromatogram(TIC)of volatile compounds derived from Shenxian bean

表3 神仙豆的游離致鮮氨基酸含量Table 3 Contents of free delicious amino acids in Shenxian bean

表4 神仙豆的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)及相對(duì)含量Table 4 Volatile compounds and their relative contents in the extracts from Shenxian bean

續(xù)表4

續(xù)表4

2.3.3 神仙豆的主要揮發(fā)性成分分析

就醚類物質(zhì)而言，醚類物質(zhì)是豆豉香氣的成分之一，賦予食品特殊香氣。神仙豆的醚類物質(zhì)相對(duì)含量最高(27.20%)，是其主要的風(fēng)味物質(zhì)。神仙豆的主要醚類風(fēng)味物質(zhì)為茴香腦、草蒿腦、2-正戊基呋喃。其中，草蒿腦、茴香腦可能主要來(lái)源于香料和辣椒等辛香料［12］。黃紅霞等［13］在對(duì)4種不同地方傳統(tǒng)豆豉的研究中曾檢測(cè)出茴香腦、草蒿腦等相似物質(zhì);秦禮康等［6］在對(duì)豆豉風(fēng)味物質(zhì)的研究中也曾檢測(cè)出2-正戊基呋喃。由于神仙豆在加工過(guò)程中通常與香料和辣椒等輔料混合炒制，故神仙豆的風(fēng)味物質(zhì)含有此類揮發(fā)性成分。

就醇類物質(zhì)而言，其相對(duì)含量次之(19.81%)。神仙豆的主要醇類化合物有2，3-丁二醇、桉樹(shù)腦、芳樟醇、1-辛烯-3-醇、α-松油醇、4-萜烯醇、苯乙醇、正己醇等。趙建新等［14］的研究認(rèn)為，2，3-丁二醇對(duì)傳統(tǒng)豆醬的風(fēng)味貢獻(xiàn)較大。趙鈺玲等［12］在對(duì)八角茴香的揮發(fā)性成分的研究中曾檢測(cè)出桉樹(shù)腦、芳樟醇等物質(zhì)，因此神仙豆中含有桉樹(shù)腦、芳樟醇等揮發(fā)性物質(zhì)可能主要來(lái)源于八角茴香等輔料。1-辛烯-3-醇也稱為“蘑菇醇”，是一種略帶蘑菇和泥土氣味的芳香物質(zhì)，秦禮康等［6］在對(duì)豆豉風(fēng)味物質(zhì)的研究中也曾大量檢測(cè)出此類物質(zhì)，且1-辛烯-3-醇被認(rèn)為是大豆的特征揮發(fā)性物質(zhì)。苯乙醇具有新鮮面包香、清甜的玫瑰樣花香，Wang等［15］在對(duì)中國(guó)傳統(tǒng)的鹽發(fā)酵豆豉的風(fēng)味研究中也曾檢出此類物質(zhì)。因此，醇類化合物對(duì)神仙豆揮發(fā)性風(fēng)味貢獻(xiàn)較大。

就含氮化合物而言，吡嗪類化合物主要是由蛋白質(zhì)、氨基酸熱分解、糖與蛋白質(zhì)或氨基酸的美拉德反應(yīng)所形成，使豆豉具有一種獨(dú)特的風(fēng)味，是構(gòu)成焙烤香味的主體物質(zhì)，此類物質(zhì)在發(fā)酵的末階段出現(xiàn)，其存在極大提高了豆豉的營(yíng)養(yǎng)保健功能。Azokpota等［16］的研究認(rèn)為，吡嗪類化合物是決定豆豉風(fēng)味的主要成分。神仙豆含氮化合物相對(duì)含量為11.34%，主要成分為 2，5-二甲基吡嗪、2，3，5-三甲基吡嗪、2，3，5，6-四甲基吡嗪等。其中 2，5-二甲基吡嗪，三甲基吡嗪具有烤香和肉香，四甲基吡嗪具有香甜和巧克力以及可可脂的香氣［10］。因此，吡嗪類化合物可能也是構(gòu)成神仙豆的主要揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)。

就醛類物質(zhì)而言，醛類物質(zhì)的閾值較低，賦予食品清香、果香和堅(jiān)果香的芳香特質(zhì)，也是豆豉和豆醬的風(fēng)味之一。神仙豆的醛類物質(zhì)相對(duì)含量為9.52%，主要為2，4-癸二烯醛、十六碳醛、壬醛、苯甲醛、苯乙醛等。2，4-癸二烯醛具有油炸食品的香味脂香，壬醛通常帶有油或蠟的令人不愉快的氣味［17］;十六碳醛具有弱的花香樣或鳶尾蠟樣的香氣［18］;苯甲醛具有令人愉快的杏仁香、堅(jiān)果香和水果香［10］;苯乙醛氣味香甜，有玫瑰花香，發(fā)酵韻味，些微壤香，類似蜜帶蠟香［7］。但在濃度低時(shí)，苯乙醛具有粗糙的青香香氣，近似風(fēng)信子香氣，可能會(huì)形成不愉快的、刺激性的、苦的風(fēng)味。

其他揮發(fā)成分分析:神仙豆的主要酮類風(fēng)味物質(zhì)為3-羥基-2-丁酮，具有強(qiáng)烈的奶油、脂肪、白脫樣香氣，占總風(fēng)味物質(zhì)的6.10%，Azokpota等［19］在枯草芽孢桿菌發(fā)酵的貝寧調(diào)味品中也檢測(cè)到3-羥基-2-丁酮。酚類物質(zhì)由于闕值較低，作為香氣成分作用十分明顯。其中，愈創(chuàng)木酚、丁香酚、苯酚、麥芽酚作為主要的風(fēng)味物質(zhì)，呈現(xiàn)不同的風(fēng)味。例如愈創(chuàng)木酚具特有的甜香香氣，微帶酚的氣息，而丁香酚呈強(qiáng)烈香辛料、丁香和發(fā)酵似香氣，似炒花生氣息。Lee等［20］在研究了其他類型豆豉后，認(rèn)為愈創(chuàng)木酚、丁香酚、麥芽酚可能對(duì)豆豉的風(fēng)味產(chǎn)生重要作用。神仙豆的主要酸類揮發(fā)性成分為2-甲基丁酸和3-甲基丁酸，例如2-甲基丁酸具有果香、奶酪、酸性的乳制品的香氣［18］，其對(duì)發(fā)酵豆醬的主要風(fēng)味有一定貢獻(xiàn)。神仙豆中的酯類揮發(fā)性成分僅檢測(cè)到2種，即乙酸芳樟酯和4-乙酰氧基苯乙烯。其中，乙酸芳樟酯具有令人愉快的花香和果香，香氣似香檸檬和薰衣草，透發(fā)而不持久［18］，對(duì)神仙豆的香氣成分也有一定貢獻(xiàn)。此外，烴類物質(zhì)雖然較易檢出，但由于其闕值較高，且氣味溫和，一般不具氣味活性，因此對(duì)香氣貢獻(xiàn)較小，通常不將其視作豆豉風(fēng)味物質(zhì)［7］。

3 結(jié)論

(1)神仙豆的水分含量約53.78%，粗蛋白含量約15.37%，粗脂肪含量約15.62%，總糖含量約8.55%，粗纖維含量約2.66%，灰分含量約3.59%，其基本成分含量和納豆非常接近，具有較高的營(yíng)養(yǎng)和食用價(jià)值。

(2)神仙豆的游離氨基酸總量為4.70 mg/g，其致鮮氨基酸含量高(2.91 mg/g)，占游離氨基酸總量的61.78%，且谷氨酸含量最高，分別占游離氨基酸總量和游離致鮮氨基酸總量的58.08%和93.81%，具有較強(qiáng)的鮮味口感。

(3)神仙豆的揮發(fā)性組分為9類72種，包括醇類(16種)、含氮類 (8種)、酯類(2種)、醛類(14種)、烴類(18種)、酮類(4 種)、酸類(3 種)、酚類(4種)、醚類(3種)，主要揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)為茴香腦、乙酸芳樟酯、3-羥基-2-丁酮、2，3，5，6-四甲基吡嗪、2，3-丁二醇、丁香酚、2，4-癸二烯醛、2，5-二甲基吡嗪、桉樹(shù)腦、2，3，5-三甲基吡嗪、草蒿腦、芳樟醇、十六碳醛、2-甲基丁酸、愈創(chuàng)木酚、3-甲基丁酸、壬醛、1-辛烯-3-醇。

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