梁慧，薛正蓮，周揚(yáng)，汪冬冬，葉楊

(安徽工程大學(xué)生物與化學(xué)工程學(xué)院，微生物發(fā)酵安徽省工程技術(shù)研究中心，安徽蕪湖，241000)

γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid，GABA)是一種非蛋白質(zhì)天然氨基酸，又稱哌啶酸、氨酪酸，化學(xué)名4-氨基丁酸，是一種非蛋白質(zhì)組成的天然氨基酸，在動(dòng)物、植物和微生物中廣泛存在［1-2］。由谷氨酸(glutamic acid，Glu)經(jīng)谷氨酸脫羧酶(Glutamate decarboxylase，簡(jiǎn)稱GAD或GDC)催化而來，是哺乳動(dòng)物中樞神經(jīng)系統(tǒng)中重要的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)［3-5］。關(guān)于GABA的測(cè)定近年來國內(nèi)外有酶法、色質(zhì)聯(lián)用法、柱層析熒光測(cè)定法、紙電泳比色、毛細(xì)管氣相色譜法、放射性受體法、毛細(xì)管電泳法、液相色譜法等，但以上方法大多成本高、費(fèi)時(shí)長，不宜用于大批量樣品的定量分析。

可見光分光光度計(jì)是常用的化合物分析測(cè)量?jī)x器［6］，酶標(biāo)儀是酶聯(lián)免疫測(cè)定的常用儀器［7］，測(cè)定物質(zhì)含量二者均服從朗伯-比爾定律:物質(zhì)在一定波長處的吸光度與濃度之間存在線性關(guān)系，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)化合物定量檢測(cè)的目的?？梢姽夥止夤舛扔?jì)法影響因素少，但操作繁瑣，試劑用量大，消耗時(shí)間長;酶標(biāo)儀影響因素較多，但速度快，效率高，試劑用量少，適于大批量樣品的快速分析［8］。

鑒于在菌種選育過程中，獲得的GABA乳酸菌突變株的數(shù)量多，通過96孔板發(fā)酵的樣品多，尋找與之相匹配的簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、快速的GABA測(cè)定方法尤為重要。本實(shí)驗(yàn)采用酶標(biāo)儀法測(cè)定GABA含量，并與分光光度計(jì)法進(jìn)行了比較，用Origin軟件對(duì)2種方法進(jìn)行擬合分析，顯示2種測(cè)定方法具有很好的一致性。到目前為止，尚未見有關(guān)酶標(biāo)儀測(cè)定GABA含量方面的相關(guān)研究報(bào)道，本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果對(duì)于快速，簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確的測(cè)定GABA具有很好的指導(dǎo)意義，為高通量選育GABA乳酸菌奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

γ-氨基丁酸(分析純)，上海元吉化工有限公司;L-Glu(純度99.9%，食品級(jí))，河南蓮花味精股份有限公司;NaClO(生化試劑)，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;H3BO3(分析純)，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑總廠;硼砂(分析純)，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑總廠;6%重蒸苯酚(生化試劑)，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;FC型酶標(biāo)儀，Thermo Fisher Scientific;常溫室壓等離子體(ARTP)，北京思清源生物科技有限公司;單道、八道手動(dòng)可調(diào)移液器，Sartorius;723N可見分光光度計(jì)，上海佑科儀器儀表有限公司;Sorvall ST 16R Centrifug，Thermo Fisher Scientific。

1.2 菌種

糞腸乳酸球菌:本實(shí)驗(yàn)室篩選獲得。

1.3 培養(yǎng)基

種子培養(yǎng)基(g/L):蛋白胨10、酵母提取物10、葡萄糖5、乙酸鈉 5、K2HPO40.2、檸檬酸三胺 0.2、MgSO40.2、MnSO40.05、吐溫 -80 0.1 mL/L，pH 6.5。115℃，滅菌25 min。

發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L):酵母提取物5、胰蛋白胨5、葡萄糖10、丁二酸鈉5、加入1%的 L-Glu，pH 6.5。115℃，滅菌25 min。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 GABA測(cè)定原理及方法

比色法測(cè)定GABA的原理:Berthelot反應(yīng)是利用苯酚和NaClO與游離氨反應(yīng)，生成藍(lán)色的吲哚酚類(Indophenol dye)，GABA在該反應(yīng)中反應(yīng)靈敏，而α-氨基酸響應(yīng)低，利用在反應(yīng)中的差別來達(dá)到測(cè)定混合氨基酸中GABA的目的［9-10］。

測(cè)定方法:參照文獻(xiàn)［10-11］進(jìn)行。吸取樣液0.8 mL，依次加入1 mol/L的 Na2CO3溶液0.2 mL，0.2 mol/L pH10.0的硼酸鹽緩沖液1 mL，6%的重蒸苯酚2 mL，混勻后加入NaClO溶液2 mL，混勻后放置4～8 min，然后沸水浴10 min，立即冰浴20 min，待溶液出現(xiàn)藍(lán)綠色后，加入4 mL 60%的乙醇溶液，混勻后放置20 min，酶標(biāo)儀在640 nm測(cè)定OD值。

1.4.2 測(cè)定方法中主要影響因素的優(yōu)化

取0.4、0.6和0.8 mol/L的標(biāo)準(zhǔn)GABA溶液0.8 mL，按1.4.1的測(cè)定方法對(duì)主要影響因素硼酸鹽緩沖液、重蒸苯酚以及NaClO的添加量進(jìn)行優(yōu)化;其中對(duì)硼酸鹽緩沖液添加量進(jìn)行優(yōu)化時(shí)0.2 mol/L pH 10.0的硼酸鹽緩沖液取值分別為0.5，0.75，1.0，1.25，1.5 mL;對(duì)6%的重蒸苯酚進(jìn)行優(yōu)化時(shí)6%的重蒸苯酚取值分別為 1.0，1.5，2.0，2.5，3.0，3.5 mL;對(duì)NaClO進(jìn)行優(yōu)化時(shí)含有效氯5.2%的NaClO溶液取值分別為 1.0，1.5，2.0，2.5，3.0 mL。

1.4.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

采用底物L(fēng)-Glu與產(chǎn)物GABA混合配制標(biāo)樣。精確配制1 g/L GABA和1 g/L L-Glu各100 mL按表1混合制成標(biāo)準(zhǔn)液。按優(yōu)化后的方法在640 nm下酶標(biāo)儀測(cè)值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，同時(shí)用可見光分光光度計(jì)在640 nm下進(jìn)行測(cè)定并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

表1 標(biāo)準(zhǔn)溶液GABA和L-Glu組成表Table 1 Ingredients of the standard mixed solution composed by GABA and glutamic acid

1.4.4 精密度試驗(yàn)

分別以濃度0.25 g/L和0.75 g/L的GABA按工作曲線的建立方法進(jìn)行同樣操作，按標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性回歸方程計(jì)算GABA的含量，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.4.5 加標(biāo)回收率試驗(yàn)

分別取配制好的 1 g/L L-Glu 9.972、9.944、9.72、7.5、2.5 mL，添加配 制好的 1 g/L GABA 0.028、0.056、0.28、2.5、7.5 mL，配制成 0.002 8、0.005 6、0.028、0.25、0.75 g/L 的 GABA 按優(yōu)化后的方法測(cè)值，并且按標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性回歸方程計(jì)算GABA的含量，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.4.6 兩種方法的擬合驗(yàn)證

將實(shí)驗(yàn)中通過ARTP誘變所獲得的75株乳酸菌突變菌經(jīng)96孔板發(fā)酵制得的發(fā)酵液離心，取上清液0.8 mL，按優(yōu)化后的方法，在640 nm下分別采用酶標(biāo)儀與可見光分光光度計(jì)進(jìn)行測(cè)值，并用origin 8.0 professional軟件擬合驗(yàn)證。

2 結(jié)果與討論

2.1 硼酸鹽緩沖液添加量的影響

按方法1.4.2所測(cè)得的結(jié)果見圖1。

圖1 硼酸鹽緩沖液添加量對(duì)吸光度的影響Fig.1 The influence of borate buffer on absorbance

如圖1所示，隨著硼酸鹽緩沖液的添加量的增加OD值出現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，且0.4、0.6與0.8 mol/L的GABA都在添加0.75 mL的0.2 mol/L pH10.0的硼酸鹽緩沖液時(shí)OD值達(dá)到最大，這是由于添加0.75 mL的0.2 mol/L pH 10.0的硼酸鹽緩沖液所達(dá)到的pH值是Berthelot反應(yīng)的最適pH值，添加量過多過少都不利于反應(yīng)的進(jìn)行，不能使反應(yīng)達(dá)到最大效率，因此本實(shí)驗(yàn)確定添加0.2 mol/L pH10.0的硼酸鹽緩沖液0.75 mL。

2.2 6%重蒸苯酚添加量的影響

按方法1.4.2所測(cè)得的結(jié)果見圖2。

圖2 6%重蒸苯酚添加量對(duì)吸光度的影響Fig.2 The influence of 6%redistilled phenol on absorbance

如圖2所示隨著6%重蒸苯酚添加量的增加，OD值呈先增加后減少的趨勢(shì)，且0.4、0.6與0.8 mol/L的GABA都在添加2.5 mL 6%重蒸苯酚時(shí)達(dá)到最高OD值，究其原因?yàn)樵贐erthelot反應(yīng)中苯酚添加量與NaClO中有效氯含量存在一定比例關(guān)系［12］;因此，本實(shí)驗(yàn)確定6%重蒸苯酚的添加量為2.5 mL。

2.3 NaClO添加量的影響

按方法1.4.2所測(cè)得的結(jié)果見圖3。

圖3 NaClO的添加量對(duì)吸光度的影響Fig.3 The influence of NaClO on absorbance

如圖3所示隨著NaClO添加量的增加，OD值呈先增加后減少的趨勢(shì)，且0.4、0.6與0.8 mol/L的GABA都在添加2 mL含有效氯5.2%的NaClO時(shí)達(dá)到最高OD值，其原因?yàn)樵贐erthelot反應(yīng)中2 mL 6%的重蒸苯酚與含有效氯5.2%的NaClO在一定pH條件下與游離氨反應(yīng)，反應(yīng)效率最高。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

按方法1.4.3分別繪制通過可見光分光光度計(jì)與酶標(biāo)儀測(cè)得的GABA濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果分別見圖4和圖5。

圖4 可見光分光光度計(jì)的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.4 The standard curve of GABA by spectrophotometer

圖5 酶標(biāo)儀的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.5 The standard curve of GABA by microplate reader

由圖5可知，GABA的濃度在0～1.0 g/L范圍內(nèi)R=0.998 9線性關(guān)系良好，可以用于GABA濃度的測(cè)定，酶標(biāo)儀法測(cè)GABA最低檢出限為0.002 8 g/L。

2.5 精密度試驗(yàn)

按方法1.4.4所測(cè)得的精密度結(jié)果見表2，該方法在低濃度和高濃度都有很好的檢測(cè)精密度，相對(duì)誤差及各組的變異系數(shù)均小于5%;表明酶標(biāo)儀法測(cè)GABA結(jié)果重現(xiàn)性好，精密度高，所得數(shù)據(jù)準(zhǔn)確。

2.6 加標(biāo)回收率試驗(yàn)

按方法1.4.5所測(cè)得的加標(biāo)回收率數(shù)據(jù)見表3，由表可知，當(dāng)加標(biāo)濃度為檢測(cè)限的10倍時(shí)，加標(biāo)回收率為92.86% ～106.07%;為檢測(cè)限的2倍時(shí)，加標(biāo)回收率為83.93% ～105.36%;而為最低檢測(cè)限時(shí)，加標(biāo)回收率為125.00%。鑒于加入過多或過少標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，均不能保證加標(biāo)樣品有較好的回收率并且一般的分析方法適用濃度范圍的中、高濃度水平，因此，對(duì)0.25、0.75 g/L GABA的加標(biāo)回收率進(jìn)行測(cè)定，加標(biāo)回收率為98.27%～103.60%，表明酶標(biāo)儀法可以用于GABA濃度的測(cè)定。

2.7 擬合曲線的建立

按方法1.4.5，分別用可見光分光光度計(jì)與酶標(biāo)儀對(duì)75株乳酸菌發(fā)酵液中GABA的含量進(jìn)行測(cè)定，并進(jìn)行擬合，驗(yàn)證兩方法之間的相關(guān)性，擬合曲線見圖6。

表2 精密度試驗(yàn)Table 2 Accuracy examinations

表3 加標(biāo)回收率Table 3 Recoveries of spiked sample

圖6 分光光度計(jì)法與酶標(biāo)儀法的擬合曲線Fig.6 The fitting curve of the spectrophotometer and enzyme-labelling measuring instrument

相關(guān)系數(shù)的正負(fù)表示的是相關(guān)的方向，而相關(guān)的強(qiáng)度決定于相關(guān)系數(shù)的絕度值。統(tǒng)計(jì)學(xué)家根據(jù)經(jīng)驗(yàn)給出了判斷相關(guān)關(guān)系強(qiáng)弱的標(biāo)準(zhǔn)，把R=0.70看成是一個(gè)中等到較高的相關(guān)［13］。本實(shí)驗(yàn)的樣本量為75，相關(guān)系數(shù)R=0.949 3，說明酶標(biāo)儀法和可見光分光光度計(jì)之間具有較高的正相關(guān)性，酶標(biāo)儀法可以作為快速、準(zhǔn)確地測(cè)定發(fā)酵液中GABA含量的有效方法。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)基于Berthelot反應(yīng)原理，對(duì)酶標(biāo)儀測(cè)定GABA含量方法的主要因素進(jìn)行優(yōu)化，并對(duì)該方法進(jìn)行精密度檢驗(yàn)，表明酶標(biāo)儀法測(cè)GABA可靠性高。本實(shí)驗(yàn)還通過分光光度計(jì)與酶標(biāo)儀對(duì)ARTP誘變獲得的75株突變株分別進(jìn)行測(cè)值并進(jìn)行擬合，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明2種測(cè)定方法具有很好的一致性。酶標(biāo)儀能快速，簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、大批量的測(cè)定發(fā)酵液中GABA含量，為高通量選育GABA乳酸菌奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

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