范金波，蔡茜彤，馮敘橋，侯宇，于曉鳳，姜沫

(渤海大學(xué)食品科學(xué)研究院，遼寧省食品安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧錦州，121013)

流行病學(xué)研究表明，日常飲食與營(yíng)養(yǎng)對(duì)于一些疾病的預(yù)防和治療發(fā)揮著重要的作用［1］。據(jù)報(bào)道攝入足量的果蔬制品可以降低心腦血管、癌癥等疾病的發(fā)病率，已被證實(shí)上述功能活性主要源于果蔬中豐富多樣的多酚成分［1］。果蔬中的多酚成分作為天然的抗氧化劑能夠阻止活性氧和活性氮的增加，調(diào)節(jié)機(jī)體內(nèi)氧化劑和抗氧化劑的穩(wěn)態(tài)，防止或減弱生物大分子的氧化損傷，從而達(dá)到降低許多慢性疾病的發(fā)病率以及延緩衰老的作用［2］。此外，多酚成分能夠形成食品中的苦味、澀味、香味、顏色以及氧化穩(wěn)定性等，是果蔬、谷物等食品感官質(zhì)量和營(yíng)養(yǎng)質(zhì)量的決定因素［3］。

多酚類(lèi)化合物指芳香烴中苯環(huán)上一個(gè)或多個(gè)氫原子被羥基取代所生成的化合物，是植物的重要次生代謝產(chǎn)物，主要包括酚酸、黃酮類(lèi)、芪、單寧和木脂素類(lèi)，其中酚酸又包括羥基肉桂酸和羥基苯甲酸類(lèi)，黃酮類(lèi)又分為黃酮醇、黃酮、黃烷醇(兒茶素)、黃烷酮、花青素和異黃酮類(lèi)［4］。天然來(lái)源的多酚成分具有多樣的生物學(xué)活性，如抗氧化、抗輻射、抗癌、降血壓等，對(duì)人類(lèi)的健康起著非常重要的作用［5］。

多酚類(lèi)物質(zhì)的抗氧化性一直是國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)，但主要以多酚混合體系的研究為主，對(duì)多酚類(lèi)物質(zhì)單體的抗氧化能力研究相對(duì)較少［6］。本文選用羥基肉桂酸、芪和黃酮的典型代表咖啡酸、白藜蘆醇和蘆丁以及根皮素和根皮苷等常見(jiàn)多酚類(lèi)物質(zhì)的單體作為研究對(duì)象，并以VC、BHT和EDTA等為對(duì)照，研究其總抗氧化能力、DPPH和ABTS自由基清除活性、鐵離子還原能力以及金屬離子螯合能力等，通過(guò)多種體外體系對(duì)上述幾種多酚類(lèi)物質(zhì)的抗氧化活性進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)，分析各多酚類(lèi)化合物的抗氧化機(jī)理，為其進(jìn)一步的開(kāi)發(fā)應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器和試劑

UV-2700紫外-可見(jiàn)光分光光度計(jì)，日本 SHIMADZU公司;JA5003電子天平，上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司;Centrifuge 5804 R冷凍離心機(jī)，德國(guó)eppendorf公司;HH-6數(shù)顯恒溫水浴鍋，國(guó)華電器有限公司;VORTEX-6電動(dòng)振蕩器，上海其林貝爾有限公司;FE-20實(shí)驗(yàn)室pH計(jì)，美國(guó)梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司。

咖啡酸、蘆丁、白藜蘆醇、根皮素、根皮苷、2，2-聯(lián)苯基-1-苦基肼基(DPPH)，百靈威科技有限公司;2，2'-聯(lián)氨-雙 (3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二胺鹽(ABTS)、菲洛嗪(Ferrozine)，合肥博美生物有限公司;K3Fe(CN)6、四水合鉬酸銨，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;2，4，6-三吡啶基三嗪(TPTZ)，阿拉丁試劑有限 公 司;乙 醇、FeCl3、FeCl2、冰 醋 酸、K2S2O8、NaH2PO4、Na2HPO4等試劑均為分析純。

1.2 總抗氧化能力

總抗氧化能力(TAC)的測(cè)定運(yùn)用鉬酸銨法，抗氧化物質(zhì)可以將Moボ還原為Moブ，并且在酸性條件下形成綠色Moブ的磷酸鹽。配制鉬酸銨反應(yīng)體系:分別稱(chēng)取2.13 g Na3PO4、0.99 g四水合鉬酸銨、6.67 mL濃H2SO4溶于200 mL水中，使其濃度依次為28 mmol/L、4 mmol/L和 0.6 mol/L，混和均勻。配制0.1 mg/mL的樣品溶液及0.01～0.09 mg/mL的VC溶液，將0.3 mL待測(cè)物加入到3 mL的鉬酸銨反應(yīng)體系中，將混合液混勻并于95℃恒溫水浴90 min，反應(yīng)液冷卻后，于695 nm處測(cè)定吸光值，以不加樣品的空白試劑調(diào)零［7］。被測(cè)物的總抗氧化能力以VC的當(dāng)量來(lái)表示［7］。

1.3 DPPH自由基清除活性

DPPH·在有機(jī)溶劑乙醇中是一種穩(wěn)定的自由基，其孤對(duì)電子在517 nm附近有強(qiáng)吸收，自由基清除劑可與孤對(duì)電子進(jìn)行配對(duì)，使吸收消失或減弱，測(cè)定吸收減弱的程度即可反映自由基清除劑的活性［8］。稱(chēng)取9.85 mg DPPH以無(wú)水乙醇定容至250 mL作為DPPH工作液，在反應(yīng)體系中，于10 mL試管中加入200 μL不同濃度的樣品溶液，再加入2 mL DPPH工作液，振蕩搖勻，于室溫下避光靜置30 min，測(cè)定517 nm處的吸光值，以加入等量的超純水作為空白對(duì)照［9］。以樣品濃度為自變量，自由基清除率為因變量作圖并進(jìn)行線(xiàn)性擬合，計(jì)算IC50值，其中IC50值定義為清除率為50%時(shí)所需抗氧化劑的濃度，所需濃度越低，表明該物質(zhì)抗氧化性越強(qiáng)［10］。

DPPH自由基清除率/%=(1-AS/A0)×100

其中:AS為樣品管的吸光值;A0為對(duì)照管的吸光值。

1.4 ABTS自由基清除活性

稱(chēng)取0.192 0 g ABTS、0.033 1 g K2S2O8于燒杯中，并用去離子水定容至50 mL，使ABTS濃度為7 mmol/L，過(guò)硫酸鉀的濃度為2.45 mmol/L，將該溶液于室溫下暗處?kù)o置12～16 h。將生成的ABTS自由基溶液用磷酸緩沖液(PBS，0.01 mol/L，pH 7.4)稀釋至734 nm處吸光值為0.70［11］。反應(yīng)體系中，于10 mL試管中加入20μL不同濃度的樣品，再加入2 mL ABTS反應(yīng)液，振蕩搖勻，室溫下靜置10 min，測(cè)定反應(yīng)液在734 nm處的吸光值，以不加入樣品的ABTS自由基溶液為空白對(duì)照，并計(jì)算IC50值。

ABTS自由基清除率/%=(1-AS/A0)×100

其中:AS為樣品管的吸光值;A0為對(duì)照管的吸光值。

1.5 鐵離子還原能力(FRAP)

稱(chēng)取0.93 g三水合乙酸鈉加入4.8 mL冰醋酸，以超純水定容至300 mL;稱(chēng)取0.093 7 g TPTZ，加入99 μL濃HCl，以超純水定容至30 mL;稱(chēng)取0.162 1 g FeCl3，加入30 mL超純水溶解搖勻。將以上3種溶液混合即得FRAP工作液。以超純水配制0.05 mg/mL樣品、BHT和VC溶液，于10 mL試管中分別加入0、100、200、300、400 μL(分析時(shí)換算成濃度)的待測(cè)物，再加入2mL FRAP工作液，振蕩搖勻，37℃下靜置10 min，測(cè)定593 nm 處吸光值［12］。

1.6 金屬離子螯合能力

以待測(cè)物對(duì)二價(jià)鐵離子(Fe2+)的清除活性來(lái)評(píng)價(jià)其金屬離子螯合能力。Fe2+可與菲咯嗪(ferrozine)反應(yīng)生成紫紅色的Fe2+-ferrozine絡(luò)合物，并于562 nm處有最大吸收，當(dāng)反應(yīng)體系中存在具有金屬螯合能力的物質(zhì)時(shí)，F(xiàn)e2+-ferrozine絡(luò)合物的形成受到抑制，表現(xiàn)為吸光值的降低［13］。參照Chung等的測(cè)定方法［14］，向2.4 mL不同濃度的樣品溶液中依次加入現(xiàn)配的 30 μL 2 mmol/L 的 FeCl2溶液和 60 μL 5 mmol/L的菲咯嗪溶液，混合均勻后室溫靜置10 min，測(cè)定混合液在562 nm處的吸光值，以等量的超純水代替樣品溶液作為空白對(duì)照。

金屬離子螯合率/%=(1-AS/A0)×100

其中:AS為樣品管的吸光值;A0為對(duì)照管的吸光值。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)測(cè)定3次，各項(xiàng)指標(biāo)的數(shù)據(jù)均用Origin 8.5軟件處理作圖，并采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。測(cè)量數(shù)據(jù)均以Mean±S.D.表示，P＜0.05認(rèn)為有顯著差異，P＜0.01認(rèn)為具有極顯著差異。

2 結(jié)果與討論

2.1 總抗氧化能力

VC的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)及各種多酚類(lèi)物質(zhì)的VC當(dāng)量，如圖1-a、圖1-b所示。由圖1-a可知，標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)在所選濃度范圍內(nèi)有較好的線(xiàn)性關(guān)系R2=0.991 2，如圖1-b所示，幾種多酚類(lèi)物質(zhì)在濃度為0.1 mg/mL時(shí)，總抗氧化能力大小依次為咖啡酸＞白藜蘆醇＞蘆?。靖ぼ眨靖に?，且上述5種多酚類(lèi)物質(zhì)總抗氧化能力的差異極顯著(P＜0.01)，其中咖啡酸的抗氧化能力最高，達(dá)到(1.873±0.022)mg VCeq/mg;其余多酚類(lèi)物質(zhì)的VC當(dāng)量依次為(0.810±0.015)、(0.684±0.018)、(0.414±0.037)、(0.199±0.012)mg VCeq/mg。

圖1 VC標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)(a)和5種多酚類(lèi)化合物的VC當(dāng)量(b)Fig.1 The standard curve of VC(a)and VCequivalent of five polyphenols(b)

咖啡酸和白藜蘆醇的分子結(jié)構(gòu)中均含有苯乙烯基結(jié)構(gòu)，且均含有3個(gè)羥基，差別在于咖啡酸相比于白藜蘆醇少一個(gè)苯環(huán)，相同質(zhì)量濃度的咖啡酸比白藜蘆醇具有更多的羥基和乙烯基，表現(xiàn)為咖啡酸具有更強(qiáng)的總抗氧化能力。蘆丁分子結(jié)構(gòu)中含有10個(gè)羥基，根皮苷有7個(gè)羥基，根皮素有4個(gè)羥基，相同質(zhì)量濃度條件下，羥基數(shù)目大小依次為蘆?。靖ぼ眨靖に?，與3種物質(zhì)總抗氧化能力相一致。由此可見(jiàn)，多酚類(lèi)物質(zhì)的總抗氧化能力與乙烯基和羥基的數(shù)目有著一定的關(guān)系。Sokó?- ??towska 等報(bào)道［15］，多酚類(lèi)化合物的性質(zhì)和應(yīng)用都根源于其獨(dú)特的化學(xué)結(jié)構(gòu)，其中酚羥基結(jié)構(gòu)是多酚類(lèi)化合物的有效基團(tuán)之一，與本研究結(jié)果相符。

2.2 DPPH自由基清除活性

以各樣品濃度為自變量，自由基清除率為因變量的線(xiàn)性擬合曲線(xiàn)如圖2所示。如圖2-a～圖2-f所示，咖啡酸、蘆丁、白藜蘆醇、根皮素和根皮苷以及2個(gè)陽(yáng)性對(duì)照BHT和VC在所選濃度范圍內(nèi)均有較好的線(xiàn)性關(guān)系，根據(jù)擬合曲線(xiàn)所求得各抗氧化劑的IC50值如表1所示。

圖2 不同濃度的咖啡酸(a)，蘆丁(b)，白藜蘆醇(c)，根皮素(d)，根皮苷(e)，BHT(f)和VC(g)對(duì)DPPH自由基的清除能力及它們的線(xiàn)性擬合結(jié)果Fig.2 Dose-dependent inhibitions of caffeine acid(a)，rutin(b)，resveratrol(c)，phloretin(d)，phlorizin(e)，BHT(f)and VC(g)on DPPH free radicals and their linearity correlation

如表1所示，在DPPH自由基清除實(shí)驗(yàn)中，各抗氧化劑均具有較強(qiáng)的清除DPPH自由基的能力，大小依次為:咖啡酸≈VC≈蘆?。景邹继J醇＞BHT＞根皮素＞根皮苷，通過(guò)鄧肯式方差分析得到，咖啡酸、VC、蘆丁在統(tǒng)計(jì)學(xué)上沒(méi)有顯著差異(P＞0.05)，其余各樣品之間均存在顯著差異(P＜0.05)。Karaman等［16］研究表明植物多酚可以作為還原劑、氫原子供體和氧自由基清除劑，個(gè)別的多酚類(lèi)物質(zhì)還具有金屬離子螯合能力;Vignoli等［17］報(bào)道咖啡飲料中酚酸的含量與DPPH自由基的清除能力呈極顯著的正相關(guān)性;Hou等［18］研究表明分子中羥基的位置與其自由基清除活性有關(guān);Huang等［19］報(bào)道生物系統(tǒng)中的pH和代謝產(chǎn)物均可使多酚類(lèi)化合物的結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，從而影響其抗氧化活性。由此可見(jiàn)，多酚類(lèi)化合物具有清除自由基的能力，且清除能力大小受多種因素控制。

表1 5種多酚化合物，BHT和VC清除DPPH和ABTS自由基的IC50值Table 1 IC50values of five phenolic compounds，BHT and VCdetermined by DPPH assay and ABTS assay

2.3 ABTS自由基清除活性

本實(shí)驗(yàn)利用過(guò)硫酸鉀將ABTS氧化成相對(duì)穩(wěn)定的藍(lán)綠色ABTS水溶性自由基，ABTS自由基既是親水型化合物又是親脂型化合物，所以較DPPH自由基更容易反應(yīng)，ABTS+·的清除是電子轉(zhuǎn)移過(guò)程，體系中的抗氧化劑與其反應(yīng)將會(huì)使溶液褪色，表現(xiàn)為吸光值的降低［20］。

以各抗氧化劑濃度為自變量，自由基清除率為因變量的線(xiàn)性擬合曲線(xiàn)如圖3所示。

從圖3中可以看出各抗氧化劑在選定的濃度范圍內(nèi)均有較好的線(xiàn)性關(guān)系。根據(jù)擬合曲線(xiàn)所求得各抗氧化劑的IC50值見(jiàn)表1。

在ABTS自由基清除實(shí)驗(yàn)中，各樣品均具有較強(qiáng)的ABTS自由基清除能力，大小依次為:白藜蘆醇＞BHT＞根皮苷＞蘆丁≈根皮素＞咖啡酸＞VC，通過(guò)方差分析得到白藜蘆醇清除ABTS自由基能力最強(qiáng)，極顯著高于陽(yáng)性對(duì)照BHT和VC(P＜0.01);蘆丁和根皮素之間沒(méi)有顯著差異(P＞0.05)，其他樣品之間均存在顯著差異。通過(guò)SPSS相關(guān)性分析可知5種多酚對(duì)上述兩種自由基的清除能力相關(guān)性較低(R2=0.1)，Wootton-Beard 等［21］研究 23 種果蔬飲料對(duì)ABTS自由基和DPPH自由基清除能力，發(fā)現(xiàn)二者相關(guān)性較低(R2=0.45)，與本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果一致。張逸波等［22］得到BHT清除ABTS的IC50值為(246.9±10.5)μmol/L即(0.054±0.002)mg/mL，與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果相近，實(shí)驗(yàn)結(jié)果的差異可能是由于氧化體系不同所致。

2.4 還原能力

由圖4可知，隨著樣品濃度的增加，吸光度值逐漸升高，即鐵離子還原能力逐漸升高，由方差分析可知，當(dāng)濃度為0.002 mg/mL時(shí)，咖啡酸與VC之間抗氧化性并沒(méi)有顯著差異(P＞0.05)，但二者均極顯著高于其他多酚類(lèi)化合物和BHT(P＜0.01);當(dāng)濃度為0.004、0.006、0.008 mg/mL 時(shí)，各抗氧化劑之間均存在極顯著差異(P＜0.01)。各樣品鐵離子還原能力大小依次為:VC＞咖啡酸＞BHT＞白藜蘆醇＞蘆?。靖に兀靖ぼ?，通過(guò)相關(guān)性分析可知5種多酚類(lèi)化合物FRAP與TAC相關(guān)性較高(R2=0.81)，且與DPPH自由基清除能力相關(guān)性較低(R2=0.64)與Wootton-Beard 等［21］研究結(jié)果相近。

2.5 金屬離子螯合能力

人體內(nèi)過(guò)量的金屬離子可引起脂質(zhì)過(guò)氧化，并進(jìn)一步誘導(dǎo)自由基和脂質(zhì)過(guò)氧化物的產(chǎn)生，因此，螯合金屬離子可通過(guò)間接的途徑達(dá)到抗氧化和抗自由基的目的［23］。研究中發(fā)現(xiàn)，咖啡酸、根皮素和根皮苷不具有金屬離子螯合能力，隨其濃度的改變，吸光值之間差異不顯著(P＞0.05)，蘆丁和白藜蘆醇的金屬螯合能力如圖5所示。

圖3 不同濃度的咖啡酸(a)，蘆丁(b)，白藜蘆醇(c)，根皮素(d)，根皮苷(e)，BHT(f)和VC(g)對(duì)ABTS自由基的清除能力及它們的線(xiàn)性擬合結(jié)果Fig.3 Dose-dependent inhibitions of caffeine acid(a)，rutin(b)，resveratrol(c)，phloretin(d)，phlorizin(e)，BHT(f)and VC(g)on ABTS free radicals and their linearity correlation

圖4 不同濃度咖啡酸，蘆丁，白藜蘆醇，根皮素，根皮苷，BHT和VC的鐵離子還原能力Fig.4 Dose-dependent ferric reducing ability of caffeine acid，rutin，resveratrol，phloretin，phlorizin，BHT and VC

從圖5中可以看出蘆丁和白藜蘆醇都有一定的螯合金屬離子的能力，且蘆丁的金屬離子螯合能力高于白藜蘆醇，由于繼續(xù)增加濃度清除率增加緩慢，所以不利于IC50值得計(jì)算，考慮可能是多酚的溶解性限制了其金屬螯合能力的發(fā)揮。陽(yáng)性對(duì)照BHT和VC具有較強(qiáng)的金屬離子螯合能力，IC50值分別達(dá)到了(6.9±0.02)μg/mL(R2:0.981)和(5.1±0.05)μg/mL(R2:0.993)，與 Gulcin等人研究結(jié)果基本一致［24］。Ebrahimzadeh 等［25］報(bào)道，果蔬提取物中酚酸和黃酮類(lèi)成分與鐵離子螯合能力相關(guān)性較弱(R2=0.4)，Ghasemi等［26］研究表明一些多酚提取物與金屬離子螯合能力具有很好的線(xiàn)性關(guān)系，但也存在一些多酚提取物無(wú)金屬離子螯合能力。可見(jiàn)金屬離子螯合能力與黃酮和酚酸的整體結(jié)構(gòu)以及羥基的位置等有關(guān)，并不是黃酮或酚酸等多酚類(lèi)化合物的共性。

3 結(jié)論

以5種體外體系對(duì)咖啡酸、蘆丁、白藜蘆醇、根皮素和根皮苷等多酚類(lèi)化合物的抗氧化活性進(jìn)行評(píng)價(jià)。結(jié)果表明咖啡酸具有極強(qiáng)的總抗氧化能力，0.1 mg/mL時(shí)達(dá)到(1.873±0.022)mg VCeq/mg;很強(qiáng)的DPPH自由基清除能力［IC50(0.023±0.004)mg/mL］，極顯著高于陽(yáng)性對(duì)照BHT;很強(qiáng)的鐵離子還原能力，極顯著高于BHT。白藜蘆醇具有極強(qiáng)的ABTS自由基清除能力［IC50(0.056±0.006)mg/mL］，極顯著高于陽(yáng)性對(duì)照BHT和VC。蘆丁金屬離子螯合能力最強(qiáng)，白藜蘆醇次之，但遠(yuǎn)不及陽(yáng)性對(duì)照BHT和EDTA，其余3種多酚化合物不具有金屬離子螯合能力。

圖5 不同濃度蘆丁(a)和白藜蘆醇(b)的金屬離子螯合能力Fig.5 Dose-dependent ferrous ions chelating activity of rutin(a)and resveratrol(b)

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