化雪艷，李碩，唐克華，劉文柱

(吉首大學林產(chǎn)化工工程湖南省重點實驗室，湖南張家界，427000)

杜仲(Eucommia ulmoides Oliver)又名木棉(木草圖經(jīng))，是杜仲科杜仲屬多年生落葉喬木，為我國特有的藥用植物，國家二級保護植物［1］;其皮和葉中含有多種藥用成分，如綠原酸［2］、黃酮［3］、桃葉珊瑚苷［4］，以及多種維生素、氨基酸，豐富的鐵、鈣、鉀、鋅、鎂、硒等礦物元素。具有降血壓、抗衰老［5］、增加肝臟細胞活性、恢復肝臟功能、增強腎細胞、通便、促進新陳代謝、增強血液循環(huán)、增強機體免疫力等藥理作用［6］;對高血壓，高血脂，心血管病，肝臟病，腰、關節(jié)痛，哮喘，腎虛，便秘，脫發(fā)，老年綜合癥均有顯著療效［7］，對肥胖治療亦有效果［8］。

中藥材及其藥渣［9-10］常被用來栽培食用菌。杜仲早已用來栽培食用菌:杜仲木耳［11］含有綠原酸、京尼平苷、京尼平苷酸等活性成分;杜仲香菇［13-14］口感鮮美，營養(yǎng)成分豐富。杜仲葉渣［19-20］栽培食用菌，生長良好且有較好的生物學效率。本試驗以杜仲葉渣及杜仲皮為基質(zhì)，研究3種食用菌固態(tài)發(fā)酵對原料的半纖維素、纖維素和木質(zhì)素的降解規(guī)律。

1 材料與儀器

1.1 材料與試劑

金針菇、猴頭菇，購自華中農(nóng)業(yè)大學菌種實驗中心;平菇，由本研究團隊從杜仲葉渣廢棄物上自然生長的平菇子實體采取組織分離與純化制備;杜仲葉渣，張家界市恒興生物科技有限公司提供;杜仲皮，購自慈利縣景龍橋鄉(xiāng)藥材商。

中性洗滌劑［15］，蒽酮試劑，地衣酚試劑［22］，均按規(guī)范配制。葡萄糖，木糖，HCl、H2SO4等試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

日立U-3900分光光度計，日立高新技術公司;HH型數(shù)顯電熱恒溫水浴鍋，江蘇金壇金城國勝實驗儀器廠;JA2003電子天平，上海良平儀表儀器有限公司;SM-52電熱高壓滅菌鍋，日本 YAMATO公司;BCM-1000A生物潔凈工作臺，蘇凈集團安泰公司;YB-1000A型高速多功能粉碎機，上海力箭機械有限公司。

2 實驗方法

2.1 菌種制備

固體菌種:PDA培養(yǎng)基［23］，將購買或自行組織分離培養(yǎng)的菌種擴繁2次，然后無菌接種到PDA固體培養(yǎng)瓶中。

液體菌種:不加瓊脂的PDA培養(yǎng)基，分裝于錐形瓶中，滅菌，靜置冷卻，接種固體菌種，置于搖床以80 r/min的振蕩速度培養(yǎng)10 d，再接種到固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)瓶時濾取菌絲球，然后無菌接種。

2.2 培養(yǎng)基制作

杜仲皮的預處理:杜仲皮洗凈，陽光下曝曬2 d，粉碎，過2 mm樣品篩，去掉杜仲膠及粗顆粒，備用。

杜仲葉渣烘曬結(jié)合干燥至輕捏即碎，輕度粉碎成小塊(不必太細)。稱取干燥粉碎杜仲葉渣，按照每份杜仲葉渣的總質(zhì)量，分別加入其總質(zhì)量分數(shù)1%的KH2PO4和Ca(OH)2，2%蔗糖，以及2%的石膏粉，攪拌混勻。加入自來水，反復揉搓攪勻，然后以塑料膜覆蓋4～6 h，用前根據(jù)經(jīng)驗微調(diào)整基質(zhì)水分在50% ～65%。基質(zhì)裝入洗凈烘干的培養(yǎng)瓶中時，要求裝料的松、緊適度，每瓶的裝料量盡可能保持一致。將裝料完畢的培養(yǎng)瓶放入高壓滅菌鍋，121℃滅菌60 min，冷卻后無菌接入菌種。每種食用菌接種30瓶，放入培養(yǎng)室，室溫培養(yǎng)。

2.3 固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物制備

2.3.1 杜仲葉渣發(fā)酵產(chǎn)物

對葉渣培養(yǎng)瓶接入菌種進行培養(yǎng)，每日觀察菌絲長勢，及時挑出雜菌污染培養(yǎng)瓶。待菌絲滿瓶(以菌絲穿透瓶內(nèi)基質(zhì)底部為標準)后，記錄培養(yǎng)時間，隔15天后第1次取樣，不同菌種的滿瓶培養(yǎng)瓶隨機取4瓶，掏出其培養(yǎng)物并置烘箱以50～60℃烘至恒重，粉碎，過40目篩，保存?zhèn)溆?。?次、第3次培養(yǎng)物的取樣，分別較前一次的取樣時間延長15 d，取樣方式及處理方法均同。

2.3.2 杜仲皮發(fā)酵產(chǎn)物

將不同菌類的固體菌種和液體菌種分別接入裝有杜仲皮基質(zhì)的培養(yǎng)瓶，觀察菌絲長勢，及時挑出雜菌污染培養(yǎng)瓶。待菌絲滿瓶后，記錄培養(yǎng)時間，隔20天后取樣，每類菌的液體、固體菌種培養(yǎng)瓶每次各取4瓶，樣品的后續(xù)處理方法同葉渣發(fā)酵培養(yǎng)產(chǎn)物的。

2.4 纖維素、半纖維素和木質(zhì)素質(zhì)量分數(shù)測定

參照王玉萬的定量分析方法，即:中性洗滌劑法、2 mol/L HCl水解法、體積分數(shù)72%H2SO4水解法、地衣酚比色定糖法和蒽酮比色定糖法，綜合應用。

2.4.1 纖維素、半纖維素質(zhì)量分數(shù)測定的標準曲線

2.4.1.1 木糖標準曲線

稱取0.100 g在90℃烘至恒重的木糖，溶于少量蒸餾水，移至1 000 mL容量瓶中，定容，得質(zhì)量濃度為100 μg/mL的標準液。此標準液以蒸餾水稀釋后得到質(zhì)量濃度分別為 0、5、10、15、20、25 μg/mL 的稀釋液。在刻度試管中加入2 mL標準液的稀釋液與8 mL地衣酚試劑，混勻后在沸水浴中保持20 min，冷水快速冷卻至室溫，掃描波長并測定吸光度，同時做空白試驗。掃描顯示在666 nm處有最大吸收波長。以木糖檢測濃度(Y1)為橫坐標，666 nm處的吸光度(X1)為縱坐標，作標準曲線，標準曲線方程:Y1=0.045 3 X1+0.052 7，R12=0.999 6。

2.4.1.2 葡萄糖標準曲線

稱取0.200 g在90℃烘至恒重的葡萄糖，溶于蒸餾水，移至1 000 mL容量瓶中，定容，制得質(zhì)量濃度為200 μg/mL的標準液。適當稀釋后，得到質(zhì)量濃度為0、10、20、40、60、80、100、200 μg/mL 的標準稀釋液。在試管中加入2 mL標準稀釋液，蒽酮試劑8 mL，混勻后放入沸水浴中加熱10 min，冷水快速冷卻，在620 nm處測定吸光度，同時做空白。以葡萄糖檢測濃度(Y2)為橫坐標，620nm的吸光度(X2)為縱坐標，作標準曲線，標準曲線方程:Y2=0.005 7 X2+0.118 6，R22=0.999 5。

2.4.1.3 半纖維素、纖維素、木質(zhì)素質(zhì)量分數(shù)

各種固態(tài)發(fā)酵樣品按步驟處理，參照標準曲線制作方法程序測定其吸光度。依據(jù)木糖標準曲線方程計算出糖含量，乘系數(shù)0.9即得所測定樣品中的半纖維素的質(zhì)量。依據(jù)葡萄糖標準曲線方程計算出糖含量，乘系數(shù)0.9即得所測定樣品中的纖維素的質(zhì)量。木質(zhì)素的質(zhì)量是根據(jù)灰化前、后的質(zhì)量差所得。

半纖維素、纖維素、木質(zhì)素在樣品中所占的質(zhì)量計算:

其中:Y，半纖維素(或纖維素，或木質(zhì)素)含量，mg/g;X1，樣品中的半纖維素(或纖維素，或木質(zhì)素)質(zhì)量，mg;X2，樣品質(zhì)量，g;X3，樣品的含水量，%。每次試驗前均測定。

3 結(jié)果

3.1 杜仲葉渣及杜仲皮的纖維素、半纖維素和木質(zhì)素含量

依據(jù)公式和標準曲線方程，計算得到杜仲葉渣的半纖維素、纖維素和木質(zhì)素質(zhì)量分數(shù)分別是:9.83、39.00和164.67 mg/g，即杜仲葉渣中木質(zhì)素含量＞纖維素含量＞半纖維素含量，與文獻［18］報道一致;杜仲皮的半纖維素、纖維素和木質(zhì)素含量分別是:32.30、108.31 和44.67 mg/g。

3.2 杜仲葉渣和杜仲皮固態(tài)發(fā)酵的菌絲滿瓶時間

表1為按方法培養(yǎng)的猴頭菇、金針菇和平菇發(fā)酵杜仲葉渣和杜仲皮的菌絲滿瓶時間。

表1 三種食用菌固態(tài)發(fā)酵杜仲的菌絲滿瓶培養(yǎng)時間/dTable 1 Full culturing time of hypha of three edible fungus/d

由表1可看出，3種食用菌在杜仲葉渣上生長時，平菇生長速度最快，金針菇次之，猴頭菇滿瓶時間最長。經(jīng)觀察，猴頭菇在菌絲萌發(fā)階段生長緩慢，但菌絲滿瓶后，呈快速生長。液體菌種和固體菌種在杜仲皮基質(zhì)上生長時，猴頭菇液體菌種發(fā)酵的菌絲滿瓶時間比固體菌種發(fā)酵的提高4 d，存在較顯著差異;金針菇、平菇的液體菌種與固體菌種發(fā)酵的菌絲滿瓶時間差距在2 d之內(nèi)，差異不顯著。而一般情況下應該是液體菌種滿瓶時間較短，也可能與裝瓶時裝料較緊，菌種萌發(fā)之后因透氣性較差導致的吃料或前進速度受到明顯影響。

3.3 三種食用菌對杜仲葉渣半纖維素、纖維素和木質(zhì)素的發(fā)酵降解規(guī)律

3種食用菌對杜仲葉渣半纖維素、纖維素和木質(zhì)素的固態(tài)發(fā)酵降解比較見圖1、圖2和圖3。

圖1 杜仲葉渣培養(yǎng)基質(zhì)的半纖維素含量變化Table 1 The variation on the mass fraction of hemicellulose in the culture medium of the leaves residual of Eucommia ulmoides Oliver

圖2 杜仲葉渣培養(yǎng)基質(zhì)的纖維素含量變化Table 2 The variation on the mass fraction of cellulose in the culture medium of the leaves residual of Eucommia ulmoides Oliver

圖3 杜仲葉渣培養(yǎng)基質(zhì)的木質(zhì)素含量變化Table 3 The variation on the mass fraction of lignin in the culture medium of the leaves residual of Eucommia ulmoides Oliver

從圖1、圖2及圖3可知，杜仲葉渣經(jīng)過平菇、猴頭菇、金針菇的固態(tài)發(fā)酵，其半纖維素、纖維素和木質(zhì)素均有一定程度的降解。菌株不同，對半纖維素、纖維素、木質(zhì)素的降解規(guī)律也是不同的［19］。

杜仲葉渣基質(zhì)經(jīng)過一段的發(fā)酵，其中半纖維素、纖維素和木質(zhì)素的降解效率如表2所示。

表2 杜仲葉渣基質(zhì)中半纖維素、纖維素和木質(zhì)素的降解效率Table 2 The degradation percent of hemicellulose，cellulose and lignin in the culture medium of the leaves residual of Eucommia ulmoides Oliver

對杜仲葉渣半纖維素的降解，隨著發(fā)酵時間延長，猴頭菇呈明顯加快態(tài)勢，而平菇、金針菇對其的降解呈較緩慢變化趨勢;3種食用菌中，猴頭菇最終可使55.29%的半纖維素降解，其生長利用杜仲葉渣半纖維素的能力稍強于金針菇和平菇的。對杜仲葉渣纖維素的降解利用，猴頭菇與金針菇的利用能力基本相當，都能利用80%左右，而平菇只能利用40.70%。對杜仲葉渣木質(zhì)素的降解利用，平菇遠比金針菇和猴頭菇的能力強，這與文獻［20］報道平菇對木質(zhì)素有特異性降解結(jié)論相符。鞠洪波［21］研究云杉木質(zhì)素及纖維素降解時發(fā)現(xiàn)，金針菇對纖維素的降解能力較強，對木質(zhì)素的降解能力較弱，這與本試驗結(jié)果一致。總體而言，猴頭菇發(fā)酵中優(yōu)先利用杜仲葉渣的半纖維素和纖維素，金針菇則優(yōu)先利用杜仲葉渣的纖維素，而平菇是優(yōu)先利用杜仲葉渣的木質(zhì)素和纖維素。

3.4 固體菌種和液體菌種對杜仲皮發(fā)酵降解的差異

3種食用菌的固體菌種和液體菌種固態(tài)發(fā)酵降解杜仲皮半纖維素、纖維素和木質(zhì)素的含量變化情況如圖4、圖5和圖6。

圖4 杜仲皮培養(yǎng)基質(zhì)的半纖維素含量變化Table 4 The variation on the mass fraction of hemicellulose in the culture medium of the bark of Eucommia ulmoides Oliver

圖5 杜仲皮培養(yǎng)基質(zhì)的纖維素含量變化Table 5 The variation on the mass fraction of cellulose in the culture medium of the bark of Eucommia ulmoides Oliver

圖6 杜仲皮培養(yǎng)基質(zhì)中木質(zhì)素含量變化Table 6 The variation on the mass fraction of lignin in the culture medium of the bark of Eucommia ulmoides Oliver

經(jīng)過每種食用菌不同類菌種的固態(tài)發(fā)酵，杜仲皮中這三者的含量均有下降。

表3 固體與液體菌種對杜仲皮基質(zhì)中半纖維素、纖維素和木質(zhì)素的降解效率/%Table 3 The degradation efficiency of hemicellulose，cellulose and lignin in the culture medium of the bark of Eucommia ulmoides Oliver/%

根據(jù)表3可知，固體菌種和液體菌種對半纖維素、纖維素和木質(zhì)素的降解幅度是有差別的，其中，差別最大的是猴頭菇菌種。除木質(zhì)素外，半纖維素、纖維素基本均是固體菌種的降解率小于液體菌種的，這主要是因為液體菌種流動性強，可覆蓋在培養(yǎng)料表面及不同深度。由于杜仲皮中纖維素和木質(zhì)素所占比例較大，綜合而言，平菇、猴頭菇固體菌種較適于發(fā)酵降解杜仲皮的木質(zhì)素，猴頭菇、金針菇的液體菌種較適于皮的纖維素發(fā)酵降解，3種菇的2類菌種對皮的半纖維素發(fā)酵降解能力差異較小。

4 結(jié)論

3種食用菌以杜仲葉渣和杜仲皮為培養(yǎng)基質(zhì)進行固態(tài)發(fā)酵時，平菇對杜仲葉渣和皮的木質(zhì)素有較特異的降解作用，金針菇、猴頭菇對杜仲葉渣和皮的纖維素利用能力較強，而且金針菇、猴頭菇的液體菌種發(fā)酵降解纖維素的能力顯著優(yōu)于固體菌種的。

有研究表明，食用菌的菌絲體成分與子實體成分相當或者高于子實體［22-23］。因此，杜仲葉渣和皮的半纖維素、纖維素、木質(zhì)素成分，通過固態(tài)發(fā)酵有明顯的降解，并轉(zhuǎn)化為食用菌菌絲體營養(yǎng)成分，有效地改善了做藥材的杜仲葉渣和皮的食用性能。

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