郝瑞芳，景浩

1(山西林業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院 園藝系，山西太原，030009)2(中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營(yíng)養(yǎng)工程學(xué)院，北京，100083)

丙烯酰胺(acrylamide，AA)是一種公認(rèn)的具有神經(jīng)毒性和潛在致癌性的物質(zhì)，已被國(guó)際癌癥研究總署列為“人類可能的致癌物”(2A類)［1］。淀粉含量高的油炸或焙烤類食品(如炸薯?xiàng)l、薯片、面包、餅干等)中含有較多的丙烯酰胺，其形成主要是食品中的天冬酰胺(asparagine，Asn)和還原糖(如葡萄糖、果糖)在高于120℃的條件下加熱，通過美拉德反應(yīng)而生成，且隨著加熱溫度的升高，丙烯酰胺的生成明顯增加［2-3］。

研究表明添加抗氧化劑如原花青素、兒茶素和生物黃酮均能夠顯著抑制模擬體系和谷物、馬鈴薯等食品體系中丙烯酰胺的生成［4-6］。已有研究證明，美拉德反應(yīng)產(chǎn)物(Maillard reaction products，MRPs)具有較強(qiáng)的抗氧化性，它是食品中的氨基化合物(氨基酸、肽及蛋白質(zhì))的ε-氨基與羰基化合物(糖類、醛、酮等)的羰基之間發(fā)生反應(yīng)生成的產(chǎn)物［7］。景浩等［8-9］研究表明，葡萄糖和核糖分別與賴氨酸和甘氨酸的美拉德反應(yīng)產(chǎn)物能夠阻止亞油酸乳化體系中脂質(zhì)過氧化，能夠清除DPPH自由基、羥自由基、超氧自由基、過氧化物。將賴氨酸/葡萄糖美拉德反應(yīng)產(chǎn)物分成高分子質(zhì)量和低分子質(zhì)量的產(chǎn)物(high and low molecular weight-lysine/glucose Maillard reaction products，H-MRPs and L-MRPs)2部分，并比較其抗氧化性。結(jié)果顯示:H-MRPs表現(xiàn)出更強(qiáng)的抗氧化性，對(duì)羥自由基和DPPH自由基的清除能力強(qiáng)于LMRPs［8］。

因此本試驗(yàn)以高、低分子質(zhì)量的賴氨酸(Lysine，Lys)/葡萄糖(glucose，Glc)美拉德反應(yīng)產(chǎn)物(H-LGP和L-LGP)為添加物，探討其對(duì)天冬酰胺/葡萄糖模式體系中丙烯酰胺的生成是否有抑制作用，同時(shí)測(cè)定模式體系的吸光值和對(duì)自由基的清除作用，考察添加物對(duì)天冬酰胺/葡萄糖模式體系的褐變程度和抗氧化性的影響。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

SPD-20A型高效液相色譜儀(日本Shimadzu公司)，配紫外檢測(cè)器;Thermo Hypersil ODS C18色譜柱(250 mm ×4.6 mm，5 mm，美國(guó)Thermo公司);680型酶標(biāo)儀(美國(guó)Bio-Rad公司)。

丙烯酰胺標(biāo)準(zhǔn)品，純度99.5% ，購(gòu)自德國(guó) Labor Dr.Ehrenstorfer-Schafers公司，賴氨酸和天冬酰胺，購(gòu)自北京拜爾迪生物公司;其他藥品均為國(guó)產(chǎn)分析純。丙烯酰胺儲(chǔ)備液濃度1.0 mg/mL;磷酸鹽緩沖液配制:稱取 KH2PO40.20 g，Na2HPO4·12H2O 2.90 g，KCl 0.20 g，NaCl 8.00 g，加900 mL 去離子水溶解，用18%的HCl調(diào)pH值至7.4，最后定容至1 L。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 反應(yīng)體系的確立

(1)賴氨酸/葡萄糖美拉德反應(yīng)產(chǎn)物(LGP)的制備:準(zhǔn)確稱取Lys 1.46 g，Glc 1.98 g，置于100 mL的容量瓶中，用磷酸鹽緩沖液(pH 7.4)溶解，調(diào)溶液pH為8.0，最后定容至100 mL，使Lys與Glc的終濃度均為0.1 mol/L。將配好的待反應(yīng)溶液加入耐高壓玻璃管中，密閉管口并置于油浴鍋中，于150℃加熱30 min，制備LGP。反應(yīng)體系的溫度用紅外測(cè)溫儀測(cè)量。反應(yīng)結(jié)束后迅速將玻璃管放入冰水混合浴中終止反應(yīng)。在LGP中加入9倍體積的無水乙醇，攪拌，于5 000×g離心10 min，收集上清液和沉淀兩部分，上清液為低分子質(zhì)量的LGP(L-LGP)，沉淀為高分子量的LGP(H-LGP)。上清液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀于40℃濃縮，最后將濃縮的上清和沉淀分別冷凍干燥，備用。

(2)天冬酰胺/葡萄糖(Asn/Glc)、Asn/Glc/HLGP和Asn/Glc/L-LGP反應(yīng)體系的確立:準(zhǔn)確稱取Asn 0.15 g，Glc 0.20 g，置于10 mL 的容量瓶中，用磷酸鹽緩沖液(pH 7.4)溶解，調(diào)溶液pH為8.0，最后定容至10 mL，使Asn與Glc的終濃度均為0.1 mol/L。再準(zhǔn)確稱取 Asn 0.15 g，Glc 0.20 g，各6份，分別置于6個(gè)10 mL的容量瓶中，每份加入不同濃度的HLGP或L-LGP，用磷酸鹽緩沖液(pH 7.4)溶解，調(diào)溶液pH為8.0，最后定容至10 mL，使Asn與Glc的終濃度均為0.1 mol/L，H-LGP和L-LGP的終濃度分別為1、5 或10 mg/mL。

然后將配好的待反應(yīng)溶液分別加入耐高壓玻璃管中，將耐壓玻璃管密閉并置于油浴鍋中，分別于150℃下加熱30 min。反應(yīng)結(jié)束后迅速將玻璃管放入冰水混合浴中終止反應(yīng)。

1.2.2 HPLC-UV分析條件

采用高效液相色譜-紫外檢測(cè)法(HPLC-UV)測(cè)定反應(yīng)體系中的丙烯酰胺含量，色譜操作條件為:色譜柱Thermo Hypersil ODS C18(250 mm×4.6 mm，5 mm)，保護(hù)柱C18(13 mm×4.0 mm，5 mm)，流動(dòng)相V(甲醇)∶V(水)=3∶97，等濃度洗脫，流速 0.7 mL/min，柱溫為室溫(25℃)，進(jìn)樣量20 mL，紫外檢測(cè)器，波長(zhǎng)204 nm。

1.2.3 反應(yīng)體系褐變程度的測(cè)定

反應(yīng)體系的褐變程度用反應(yīng)產(chǎn)物在450 nm處的吸光值(OD450)表示。取加熱過的各反應(yīng)產(chǎn)物，稀釋5倍，加入到96孔培養(yǎng)板，每孔100 μL，每個(gè)反應(yīng)產(chǎn)物設(shè)3個(gè)復(fù)孔，用680型酶標(biāo)儀測(cè)定各反應(yīng)產(chǎn)物OD450。

1.2.4 反應(yīng)體系抗氧化性的測(cè)定

1.2.4.1 ABTS法

取各反應(yīng)產(chǎn)物100 μL，用去離子水稀釋10倍，測(cè)定其對(duì)自由基ABTS的清除率。具體方法如下:取稀釋過的反應(yīng)產(chǎn)物10 μL，加入90 μL的ABTS溶液，混勻，閉光放置1 min～6 min后，于630 nm處測(cè)定吸光值。用PBS代替反應(yīng)產(chǎn)物作為對(duì)照組［10］。

1.2.4.2 DPPH法

取各反應(yīng)產(chǎn)物200 μL，用去離子水稀釋5倍，測(cè)定其對(duì)自由基DPPH的清除率。具體方法如下:用無水乙醇配制1.52×10-4mol/L的DPPH溶液。測(cè)定時(shí)取稀釋過的反應(yīng)產(chǎn)物15 μL，加入60 μL濃度為0.5 mol/L的Tris-HCl溶液，再加入150 μL配制好的DPPH溶液，室溫閉光放置30 min，然后于520 nm處測(cè)定吸光值。用PBS代替反應(yīng)產(chǎn)物作為對(duì)照［8］。

1.2.5 統(tǒng)計(jì)分析

每個(gè)試驗(yàn)重復(fù)3次，每個(gè)測(cè)定3次，結(jié)果表示為Means±SD。采用MINITAB 13.20軟件進(jìn)行One-way ANOVA分析。鄧肯氏多重檢驗(yàn)用來確定數(shù)據(jù)間的差異，顯著水平為P＜0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 LGP對(duì)Asn/Glc反應(yīng)體系中丙烯酰胺生成的影響

圖1顯示了LGP對(duì)Asn/Glc反應(yīng)體系中丙烯酰胺生成的影響。

圖1 H-LGP和L-LGP對(duì)Asn/Glc反應(yīng)體系中丙烯酰胺生成的影響Fig.1 Effects of H-LGP and L-LGP on acrylamide formation in the Asn/Glc model system

高、低分子質(zhì)量的賴氨酸/葡萄糖美拉德反應(yīng)產(chǎn)物(H-LGP和L-LGP)都對(duì)體系中丙烯酰胺的生成有顯著的抑制作用，添加物的濃度越高，抑制率也越強(qiáng)。當(dāng)添加1、5、10 mg/mL的H-LGP時(shí)，對(duì)Asn/Glc體系中丙烯酰胺生成的抑制率分別為12.3%、23.4%、32.0%;添加 1、5、10 mg/mL 的 L-LGP 時(shí)，對(duì)丙烯酰胺的抑制率分別為7.3%、16.9%、31.4%。可以看出，H-LGP對(duì)丙烯酰胺的抑制作用略強(qiáng)于L-LGP，當(dāng)添加量都為10 mg/mL時(shí)，二者無差異。

美拉德反應(yīng)十分復(fù)雜，反應(yīng)過程分為初期、中期和末期3個(gè)階段，在加熱食品中已檢測(cè)到的、結(jié)構(gòu)明確的與美拉德反應(yīng)有關(guān)的產(chǎn)物約有800多種，很多產(chǎn)物具有一定的生物活性，產(chǎn)物中某些產(chǎn)物可能對(duì)丙烯酰胺的生成有抑制作用［4］。本實(shí)驗(yàn)的研究結(jié)果也表明H-LGP和L-LGP對(duì)Asn/Glc反應(yīng)體系中丙烯酰胺的生成有顯著的抑制作用。

H-LGP和L-LGP具有很好的抗氧化性，能夠阻止亞油酸乳化體系中脂質(zhì)過氧化，能夠清除DPPH自由基和氧自由基［8］。已有研究表明，在Asn/Glc模式體系和食品體系中添加抗氧化劑柚皮素、原花青素和生物黃酮均能有效抑制丙烯酰胺的形成［6，11-13］，生物黃酮對(duì)丙烯酰胺的抑制作用與體系的抗氧化性變化之間存在顯著的相關(guān)性。因此，推測(cè)LGP對(duì)Asn/Glc反應(yīng)體系中丙烯酰胺生成的抑制作用可能與LGP的抗氧化性有一定的相關(guān)性，抑制機(jī)理有待于更深入的研究。

2.2 LGP對(duì)Asn/Glc反應(yīng)體系褐變程度的影響

如圖2所示，對(duì)照組Asn/Glc體系于150℃下加熱30 min后，體系的褐變程度顯著增加，OD450達(dá)到0.75。

圖2 H-LGP和L-LGP對(duì)Asn/Glc反應(yīng)體系吸光值的影響Fig.2 Effects of H-LGP and L-LGP on Absorbance of Asn/Glc model system

分別添加低、中濃度的H-LGP和L-LGP后，Asn/Glc/LGP體系的OD450在0.7～0.8之間，和對(duì)照組相比無顯著差異，說明低、中濃度的LGP對(duì)Asn/Glc反應(yīng)體系的褐變無影響。當(dāng)添加高濃度的LGP，整個(gè)反應(yīng)體系的OD450顯著增加，且在加熱的過程中它們的顏色會(huì)隨反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸加深［14］。整個(gè)體系的褐變程度增加，原因可能有以下3方面:(1)H-LGP和L-LGP溶液本身呈褐色，濃度越高，溶液的顏色也越深，添加高濃度的LGP后，加熱前整個(gè)體系的顏色就偏淺黃色;經(jīng)150℃下加熱30 min后，由于LGP中還含有未反應(yīng)完全的Lys和Glc，二者可繼續(xù)發(fā)生美拉德反應(yīng)，產(chǎn)生褐色的產(chǎn)物;(2)體系中的Asn和Glc同時(shí)也在高溫加熱過程中發(fā)生美拉德反應(yīng)，不僅生成了丙烯酰胺，還生成了其他褐色的產(chǎn)物;(3)LGP參與了體系的反應(yīng)，使整個(gè)體系的顏色加深，褐變程度顯著高于對(duì)照組。

2.3 LGP對(duì)Asn/Glc反應(yīng)體系抗氧化性的影響

各反應(yīng)體系的抗氧化性用反應(yīng)產(chǎn)物對(duì)自由基DPPH和ABTS的清除率來表示。

H-LGP和L-LGP對(duì)Asn/Glc體系的DPPH自由基清除率的影響如圖3所示。分別將H-LGP和LLGP加到 Asn/Glc體系中加熱30 min后，只有10 mg/mL的H-LGP和L-LGP增強(qiáng)了整個(gè)反應(yīng)體系對(duì)DPPH自由基的清除率，和對(duì)照組相比，清除率分別提高了17.7%和9.2%;中、低濃度的2種LGP和對(duì)照相比無顯著差異。

圖3 H-LGP和L-LGP對(duì)Asn/Glc體系DPPH自由基清除率的影響Fig.3 Effects of H-LGP and L-LGP on DPPH scavenging rate in the Asn/Glc model system

H-LGP和L-LGP對(duì)Asn/Glc體系的ABTS自由基清除率的影響如圖4所示。3個(gè)濃度的LGP均顯著提高了反應(yīng)體系對(duì)ABTS自由基的清除率。同一組中，1 mg/mL和5 mg/mL的濃度組之間無差異，而10 mg/mL的濃度組對(duì)ABTS的清除率不僅顯著高于對(duì)照組，還顯著高于1 mg/mL和5 mg/mL的濃度組。和對(duì)照組相比，添加H-LGP和L-LGP后整個(gè)體系對(duì)ABTS的最大清除率分別提高了29.0%和22.3%，HLGP的ABTS自由基清除率略高于L-LGP。

圖4 H-LGP和L-LGP對(duì)Asn/Glc體系A(chǔ)BTS自由基清除率的影響Fig.4 Effects of H-LGP and L-LGP on ABTS scavenging rate in the Asn/Glc model system

研究表明，美拉德反應(yīng)產(chǎn)物(MRPs)中的類黑素、還原酮以及一些含N、S的雜環(huán)化合物具有一定的抗氧化活性，其中類黑素被認(rèn)為是主要的抗氧化成分，具有較強(qiáng)的抗ABTS自由基能力，大分子質(zhì)量的類黑素能夠抑制還原型輔酶Ⅱ和谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶的活性，而小分子量的類黑素則可抑制還原型輔酶Ⅱ的活性。除此之外，在谷物油中添加類黑素也能明顯降低其過氧化值［15］。本試驗(yàn)也表明賴氨酸/葡萄糖美拉德反應(yīng)產(chǎn)物具有一定的抗氧化活性，添加到反應(yīng)體系中能夠增強(qiáng)體系的抗氧化活性。

3 結(jié)論

LGP(1、5、10 mg/mL)對(duì) Asn/Glc 模式反應(yīng)體系中丙烯酰胺的生成有顯著的抑制作用，且濃度越大，對(duì)丙烯酰胺生成的抑制作用越強(qiáng)。低、中濃度的LGP對(duì)Asn/Glc體系的褐變程度無影響，但高濃度的LGP則促進(jìn)了Asn/Glc體系的褐變程度。低、中、高濃度的LGP均顯著促進(jìn)了Asn/Glc體系對(duì)ABTS自由基的清除作用，而對(duì)DPPH自由基的清除作用中，只有高濃度的L-LGP有顯著的促進(jìn)作用。H-LGP和LLGP相比較，二者對(duì)Asn/Glc反應(yīng)體系中丙烯酰胺的生成、對(duì)體系的褐變及抗氧化性的影響均無顯著差異。

［1］ International Agency for Research on Cancer(IARC).Some industrial chemicals.Monographs on the Evaluation of Carcinogenic Ricks to Humans，1994，60:398-433.

［2］ Stadler R H，Blank I，Varga N，et al.Food Chemistry:Acrylamide from Maillard reaction products［J］.Nature，2002，419:449-450.

［3］ Mottram D S，Wedzicha B L，Dodson A T.Food Chemistry:Acrylamide is formed in the Maillard reaction［J］.Nature，2002，419:448-449.

［4］ Fernández S，Kurppa L，Hyv?nen L.Content of acrylamide decreased in potato chips with addition of a proprietary flavonoid spice mix(Flavomare)in frying［J］.Innovative Food Technology，2003，(Feb):2-3.

［5］ Ciesarova Z，Suhaj M，Horvathova J.Correlation between acrylamide contents and antioxidant capacities of spice extracts in a model potato matrix ［J］.Journal of Food and Nutrition Research，2008，47:1-5.

［6］ Cheng Ka-wing，Shi Jian-jun，Ou Shi-yi，et al.Effects of fruit extracts on the formation of acrylamide in model reactions and fried potato crisps［J］.Journal of Agricultural and Food Chemistry，2010，58:309-312.

［7］ Mlotkiewicz J A.The Royal Society of Chemistry［M］.London(UK):Cambridge，1998:19-27.

［8］ Jing Hao，Kitts D D.Antioxidant activity of sugar-lysine Maillard reaction products in cell free and cell culture systems ［J］.Archives of Biochemistry and Biophysics，2004，429:154-163.

［9］ Chen Xiu-min，Kitts D D.Antioxidant activity and chemical properties of crude and fractionated Maillard reaction products derived from four sugar-amino acid Maillard reaction model systems［J］.Annals of the New York Academy of Science，2008，1 126:220-224.

［10］ Re R，Pellegrini N，Proteggente A，et al.Antioxidant activity applying an improved ABTS radical cation decolorization assay ［J］.Free Radical Biology and Medicine，1999，26:1 231-1 237.

［11］ CHENG Ka-wing，ZENG Xiao-hui，TANG Yun-sang，et al.Inhibitory mechanism of naringenin against carcinogenic acrylamide formation and nonenzymatic browning in Maillard model reactions［J］.Chemical Research in Toxicology，2009，22:1 483-1 489.

［12］ ZHANG Yu，ZHANG Ying.Effect of natural antioxidants on kinetic behavior of acrylamide formation and elimination in low-moisture asparagine-glucose model system［J］.Journal of Food Engineering，2008，85:105-115.

［13］ ZHANG Y，ZHANG Y.Study on reduction of acrylamide in fried bread sticks by addition of antioxidant of bamboo leaves and extract of green tea［J］.Asia Pacific Journal of Clinical Nutrition，2007，16(Suppl 1):131-136.

［14］ Friedman M.Food browning and its prevention:an overview ［J］.Journal of Agricultural and Food Chemistry，1996，44:631-653.

［15］ Wagner K H，Derkits S，Herr M，et al.Antioxideative potential of melanoidins isolated from a roasted glucoseglycine model［J］.Food Chemistry，2002，78(3):375-382.