張晶晶，鄭惠娜，章超樺，郝記明，張靜，范朝泳

(廣東省水產(chǎn)品加工與安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東普通高等學(xué)校水產(chǎn)品深加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，國家貝類加工技術(shù)研發(fā)分中心(湛江)，廣東海洋大學(xué)食品科技學(xué)院，廣東湛江，524088)

牡蠣屬軟體動(dòng)物門，雙殼綱，珍珠貝目，牡蠣科，俗稱蠔，別名蠣黃、蠔白、海蠣子。牡蠣是一種珍貴的海產(chǎn)軟體動(dòng)物，它不僅是一種著名的海產(chǎn)貝類，而且是一種天然保健食品。我國每年牡蠣產(chǎn)量居全球首位，2012年牡蠣產(chǎn)量達(dá)394.88×104t，占貝類養(yǎng)殖產(chǎn)量的 32.68%［1］。

蛋白質(zhì)會(huì)對(duì)食品的質(zhì)構(gòu)、風(fēng)味和加工性狀產(chǎn)生重大影響，這主要是因?yàn)榈鞍踪|(zhì)具有不同的功能性質(zhì)。首先判斷蛋白質(zhì)是否具有潛在應(yīng)用價(jià)值的一個(gè)指標(biāo)就是蛋白質(zhì)的溶解性，起始溶解性較大的蛋白質(zhì)，有利于蛋白質(zhì)其他功能性質(zhì)的提高。水產(chǎn)蛋白的熱穩(wěn)定性和化學(xué)穩(wěn)定性較低，容易變性，在牡蠣蛋白提取過程中也有不同程度的變性，其中冷凍干燥的影響最大，導(dǎo)致其溶解性和乳化性不佳，不能完全滿足食品加工的需求，所以在食品加工中的應(yīng)用受到限制。因此，對(duì)牡蠣蛋白進(jìn)行改性，提高牡蠣蛋白制品營養(yǎng)成分的生物有效、利用性成為食品加工業(yè)亟待解決的問題。

酶法改性是一種常用的改性方法，可以得到功能特性優(yōu)良的蛋白［2］。酶水解程度不同導(dǎo)致牡蠣蛋白結(jié)構(gòu)等方面的改變也不同，通過酶改性可得到滿足不同需求的功能性牡蠣蛋白質(zhì)，從而拓寬牡蠣蛋白在食品工業(yè)中應(yīng)用的范圍［3］。目前，國內(nèi)外學(xué)者在蛋白的改性研究方面做了許多工作［4-5］。Adler-Nissen和Olsen［6］研究發(fā)現(xiàn)，大豆分離蛋白經(jīng)堿性蛋白酶和中性蛋白酶有限酶解后，溶解性和乳化性都有很大的提高。Qi Hettiarachchy 和 Kalapathy［7］同樣證明酶法改性的效果，研究證明適當(dāng)?shù)拿附獾鞍卓梢蕴岣叩鞍椎娜芙庑浴⑷榛?、乳化穩(wěn)定性和起泡能力。然而，有關(guān)酶法改性的研究大多數(shù)是以魚蛋白為對(duì)象，而對(duì)貝類的酶法改性研究，報(bào)道較少。

本研究在前期對(duì)牡蠣蛋白進(jìn)行分離并研究其功能特性中發(fā)現(xiàn)，水溶性蛋白和鹽溶性蛋白的溶解性和乳化性均不佳，故分別使用了胰蛋白酶和堿性蛋白酶對(duì)3種牡蠣蛋白分離組分進(jìn)行水解，并對(duì)牡蠣蛋白各個(gè)時(shí)間段的酶解產(chǎn)物的溶解性和乳化性的變化趨勢(shì)進(jìn)行了比較，獲取具有更佳功能特性的蛋白，為進(jìn)一步利用牡蠣蛋白提供理論參考。

1 材料和方法

1.1 試劑材料

胰蛋白酶(trypsin)，活力單位25萬 U/g，購于Simga公司;堿性蛋白酶(Alcalase)Alcalase 2.4 L，活力單位20萬U/g，購于諾維信公司。金龍魚特香花生油為食品級(jí)，益海嘉里食品營銷有限公司產(chǎn)品。試劑均為分析純。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

PHS-25數(shù)顯pH計(jì)，上?？祪x儀器有限公司;BL-6205精密電子天平，上海市島津制作所;CR22G高速冷凍離心機(jī)，日本Hitachi公司;TJ12-A絞肉機(jī)，廣東番禹恒聯(lián)食品機(jī)械廠;T25高剪切乳化分散機(jī)德國IKA;UV-2102PC紫外分光光度計(jì)，尤尼柯(上海)儀器有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 牡蠣蛋白的制備

牡蠣蛋白組分的制備參考文獻(xiàn)［8］的制備方法。

1.3.2 酶法改性

配制質(zhì)量濃度為5%的蛋白溶液，用1 mol/L NaOH調(diào)pH至8.0，分別加入胰蛋白酶和堿性蛋白酶(加酶量 E/S=1∶200)分別反應(yīng) 10、20、30、40、50、70、110、150、200 min，采用甲醛滴定法測(cè)定水解度。反應(yīng)結(jié)束后，100℃滅酶10 min，冷卻后離心(4℃，5 000 r/min，15 min)，取上清液調(diào) pH至7.0。對(duì)照樣在不加酶的情況下同上操作。

1.3.3 水解度的測(cè)定［6］

吸取5 mL樣液，置于100 mL容量瓶中，加水至刻度，混勻后吸取20 mL，置于200 mL燒杯中，加60 mL水，開動(dòng)磁力攪拌器，用0.05 mol/L NaOH滴定至酸度計(jì)顯示pH=8.2，記下消耗的NaOH體積，加入10 mL甲醛混勻，再用NaOH繼續(xù)滴定至pH=9.2，記下消耗的NaOH體積:

式中:X4為樣品中氨基態(tài)氮含量(以氮計(jì))，g/100 mL;V4為滴定樣品稀釋液消耗0.05 mol/L NaOH標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液的體積，mL;V3為空白試驗(yàn)消耗0.05 mol/L NaOH標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液的體積，mL;V5為樣品稀釋液用來，mL;C3為NaOH標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液濃度，mol/L;0.014為1.00 mL NaOH標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液相當(dāng)于氮的質(zhì)量，g。

1.3.4 溶解性的測(cè)定［9］

考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定上清液蛋白質(zhì)含量

1.3.5 乳化性的測(cè)定［10］

取蛋白濃度為0.5%(w/v)的蛋白液9 mL于25 mL量杯中，加入3 mL花生油，分別調(diào)節(jié)pH值為7，均質(zhì)1 min(固定一個(gè)位置，轉(zhuǎn)速約12 000 r/min)。迅速從量杯底部取20 μL清液加入到5 mL 0.1%(w/v)的SDS溶液中，搖勻，立即在500 nm波長下比色(以0.1%SDS為空白)測(cè)定0 min的吸光值(A0)，放置10 min后再取樣同上檢測(cè)吸光值(Al)。以A1表示乳化活力指數(shù)(EAI)，乳化穩(wěn)定性指數(shù)(ESI)表示為:

式中:D為稀釋倍數(shù)，D=250;C為蛋白質(zhì)濃度，g/mL;Φ為油相所占的比例，Φ=1/4;L為比色皿的厚度，L=1 cm;△t=10 min。

1.3.6 數(shù)據(jù)分析

采用Excel作圖，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS軟件進(jìn)行多重比較分析，結(jié)果用不同字母表示顯著性差異(P＜0.05)，數(shù)據(jù)均為3次數(shù)值的平均值。

2 結(jié)果與討論

2.1 胰蛋白酶水解3種蛋白組分的水解情況比較

按照1.4.2的方法，用胰蛋白酶對(duì)水溶性蛋白、鹽溶性蛋白和不溶性蛋白進(jìn)行可控酶解，酶解過程中水解度隨時(shí)間變化如圖1所示。

圖1 胰蛋白酶水解牡蠣水溶性、鹽溶性和不溶性蛋白的水解度比較結(jié)果Fig.1 The degree of hydrolysis of oyster water-soluble，salt soluble and insoluble protein hydrolysated by trypsin(不同字母表示具有顯著性差異(P＜0.05))

反應(yīng)起始階段，底物濃度大，肽鏈的斷裂速度較快，在前70 min內(nèi)水解速度較快，之后水解度仍在增大但增加的速度趨于平緩，比較而言，水溶性蛋白最容易被水解，其次是鹽溶性蛋白和不溶性蛋白。反應(yīng)進(jìn)行200 min后，胰蛋白酶水解水溶性蛋白的產(chǎn)物的水解度可達(dá)15.69%。胰蛋白酶是屬于絲氨酸蛋白酶中的一種，切開肽鍵羧基端的精氨酸和賴氨酸，肽鏈長度適中。這主要是因?yàn)殡S著水解的進(jìn)行，分子變小，每個(gè)分子中酶可作用的位點(diǎn)減少，因而酶將分子切斷成更小的分子的速度變慢。水解度越高就表示肽鍵被切斷的數(shù)目越多，越多的游離氨基酸和小肽的生成。但是水解度過高時(shí)，暴露了肽鏈中的疏水性氨基酸而產(chǎn)生苦味肽，影響蛋白質(zhì)的功能性質(zhì)［11］。水溶性蛋白由于其本身易溶于水的性質(zhì)，分子量較小，肽鏈較短，在短時(shí)間內(nèi)蛋白酶就能達(dá)到很好的剪切效果。鹽溶性蛋白主要是肌原纖維蛋白，而胰蛋白酶對(duì)肌原纖維蛋白有較好的水解能力。任嬌艷［12］用木瓜蛋白酶、菠蘿蛋白酶、Neutrase1.5 MG、Alcalase2.4L和PTN6.0分別水解羅非魚的肌漿蛋白和肌原纖維蛋白，發(fā)現(xiàn)相同蛋白酶作用于肌原纖維蛋白所得酶解產(chǎn)物的水解度略低于肌漿蛋白酶解產(chǎn)物，這也與肌原纖維蛋白的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)有關(guān)。這與牡蠣水溶性蛋白和鹽溶性蛋白的結(jié)果相似。不溶性蛋白的主要成分是基質(zhì)蛋白，由于基質(zhì)蛋白的結(jié)構(gòu)性質(zhì)，不溶性蛋白相對(duì)難以被水解。隨著水解時(shí)間的延長，水解度一直增加，在反應(yīng)200 min后最高達(dá)到10.93%。

2.2 堿性蛋白酶水解3種蛋白組分的水解情況比較

按照1.4.2的方法，水溶性蛋白、鹽溶性蛋白和不溶性蛋白經(jīng)堿性蛋白酶水解的水解情況如圖2所示。

圖2 堿性蛋白酶水解牡蠣水溶性、鹽溶性和不溶性蛋白的水解度比較結(jié)果Fig.2 The degree ofhydrolysis of oyster water-soluble，salt soluble and insoluble protein hydrolysated by alcalase(不同字母表示具有顯著性差異(P＜0.05))

堿性蛋白酶對(duì)3種蛋白的酶解情況與胰蛋白酶的水解度的變化趨勢(shì)基本相似。蛋白酶對(duì)蛋白的不同水解特性主要與其專一性有關(guān)。堿性蛋白酶是一種非特異性肽鍵內(nèi)切酶，主要作用于含疏水性羥基的肽鍵，釋放的肽鏈更短，產(chǎn)率高。由圖1和2的對(duì)比，發(fā)現(xiàn)3種樣品在相同酶解時(shí)間下，堿性蛋白酶水解產(chǎn)物的水解度都比胰蛋白酶水解產(chǎn)物的水解度高，反應(yīng)200 min堿性蛋白酶水解產(chǎn)物的水解度最高可達(dá)16.56%。施雪［13］用堿性蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶、中性蛋白酶和胰蛋白酶在最適條件下對(duì)鯉魚肉蛋白分別進(jìn)行酶解，結(jié)果表明在所有的水解樣品中，堿性蛋白酶水解產(chǎn)物的水解度最高。同時(shí)在水解初期水解度都很低，同樣由于堿性蛋白酶的強(qiáng)水解蛋白的能力，相對(duì)應(yīng)堿性蛋白酶酶解產(chǎn)物的水解度高于胰蛋白酶的。任增超［14］用六種蛋白酶對(duì)羅非魚下腳料蛋白酶解后，也發(fā)現(xiàn)堿性蛋白酶的水解效率最高。

2.3 酶法改性對(duì)溶解性的影響

圖3所示為不同水解度下水溶性蛋白、鹽溶性蛋白和不溶性蛋白的堿性蛋白酶和胰蛋白酶水解產(chǎn)物溶解性的變化。由圖3可知，2種蛋白酶酶解產(chǎn)物隨水解度的變化趨勢(shì)基本相似。隨著水解度的增加，水溶性蛋白、鹽溶性蛋白和不溶性蛋白酶解產(chǎn)物的溶解性也增加，其后隨著時(shí)間的延長呈緩慢的增加趨勢(shì)，且均高于牡蠣各蛋白組分本身的溶解性。比較而言，堿性蛋白酶酶解產(chǎn)物的溶解性較好?？赡苡捎诿阜ㄋ夂螅鞍踪|(zhì)的結(jié)構(gòu)被破壞進(jìn)而疏水基團(tuán)暴露，分子量減小，親水性增加，蛋白的結(jié)構(gòu)發(fā)生了有利于提高溶解性的變化［15］。正如 Gbogouri GA 等［16］用 Alcalase(R)蛋白酶水解三文魚的研究結(jié)果，都表明水解度越高。溶解性越好。王素雅［17］等同樣發(fā)現(xiàn)水解菜籽蛋白后，隨著水解度的增加，溶解性也增加。

在pH7.0時(shí)，水溶性蛋白的溶解性由原來的48.50%提高到82.71%，提高了1.7倍，水解度在達(dá)到8%之前，溶解性變化較小。鹽溶性蛋白的溶解性提高了2.3倍，最高達(dá)91.04%，水解度3%前溶解性變化較小，隨后急劇增加。由此看出酶解作用對(duì)鹽溶性蛋白的溶解性的提高顯著強(qiáng)于水溶性蛋白。不溶性蛋白由于其溶解性質(zhì)，幾乎不溶解，但是經(jīng)過兩種酶水解后，結(jié)果表明，堿性蛋白酶和胰蛋白酶的水解產(chǎn)物分別最高為46.71%和46.25%，水解度3%時(shí)，溶解性變化不大，之后溶解性呈平緩的增加趨勢(shì)，較不溶性蛋白的溶解性質(zhì)，有很明顯的改善。Quaglia［18］研究比較沙丁魚的水解產(chǎn)物與本身蛋白的溶解性，也表明酶解能顯著提高溶解性。大麻分離蛋白經(jīng)酶解后，發(fā)現(xiàn)水解度在2.3% ～6.7%顯著提高蛋白的溶解性［19］，這與牡蠣鹽溶性蛋白和不溶性蛋白在水解度3%后溶解性提高的結(jié)果相近，但與小麥蛋白酶解產(chǎn)物不同［20］。

2.4 酶法改性對(duì)乳化性的影響

由圖4總體來看，牡蠣3種蛋白胰蛋白酶和堿性蛋白酶水解產(chǎn)物的乳化活性和乳化穩(wěn)定性是呈先升高后降低的趨勢(shì)。隨著水解度的增大，對(duì)維持蛋白質(zhì)穩(wěn)定結(jié)構(gòu)的氫鍵、范德華力、離子鍵等鍵破壞程度也越來越大，包裹在油滴表面的肽段越來越小，使油滴表面的保護(hù)層越來越薄，最終導(dǎo)致了乳化性的降低，也導(dǎo)致了乳化穩(wěn)定性的降低［16］。

圖3 牡蠣水溶性、鹽溶性和不溶性蛋白酶解產(chǎn)物的溶解性Fig.3 The solubility of oyster water-soluble，salt soluble and insoluble protein hydrolysates by different proteases

圖4 牡蠣水溶性、鹽溶性和不溶性蛋白酶解產(chǎn)物的乳化性和乳化穩(wěn)定性Fig.4 The EAI and ESI of oyster water-soluble，salt soluble and insoluble protein hydrolysates by different proteases

水溶性蛋白胰蛋白酶和堿性蛋白酶的水解產(chǎn)物在反應(yīng)50 min時(shí)，此時(shí)水解度為7.0%和7.2%時(shí)，乳化活性達(dá)到最高分別為86.63 m2/g、87.11 m2/g，乳化活力提高了1.8倍，乳化性明顯好于羅非魚下腳料，隨著水解度增加，酶解產(chǎn)物的乳化性低于原料本身。水解產(chǎn)物的乳化穩(wěn)定性大多數(shù)低于水溶性蛋白本身的乳化穩(wěn)定性，但乳化穩(wěn)定性高于大豆分離蛋白。堿性蛋白酶的水解產(chǎn)物的水解度較高于胰蛋白酶的，而胰蛋白酶的水解產(chǎn)物乳化穩(wěn)定性較好。鹽溶性蛋白胰蛋白酶和堿性蛋白酶的水解產(chǎn)物在水解度為4.4%和5.8%時(shí)，乳化活性達(dá)到最高，相比原料本身的乳化活力，提高了1.8倍，乳化穩(wěn)定性提高了2.4倍，水解產(chǎn)物的乳化性和乳化穩(wěn)定性一直高于鹽溶性蛋白本身。不溶性蛋白的胰蛋白酶和堿性蛋白酶酶解產(chǎn)物分別在水解度5.7%和6.4%時(shí)，乳化活力和乳化穩(wěn)定性均達(dá)到最高，且胰蛋白酶酶解后的乳化性較好，堿性蛋白酶的乳化穩(wěn)定性較好。Sathivel等［21］對(duì)紅鮭魚進(jìn)行酶解實(shí)驗(yàn)，研究表明酶解程度加深，溶解性增加，水解度在一定程度上，產(chǎn)物的乳化性最好。楊東等［22］研究鰱魚水解蛋白同樣表明一定程度的酶解提高乳化性，水解度增加反而降低乳化性。Chabanon等［23］報(bào)道從油菜籽蛋白中分離出的白蛋白和球蛋白經(jīng)有限的水解處理后，乳化活力增加，當(dāng)水解度過高時(shí)乳液的穩(wěn)定性降低。同樣Taha［24］發(fā)現(xiàn)油料子蛋白酶解處理后水解度與溶解性有直接的關(guān)系，低水解度的水解后乳化性有所提高。牡蠣蛋白經(jīng)水解后的乳化性和乳化穩(wěn)定性變化情況與這些研究結(jié)果相似，也充分證明了有限的水解能改善乳化性，這可能歸因于疏水蛋白質(zhì)的暴露提高吸附力從而形成一個(gè)有凝聚力的界面膜，加強(qiáng)疏水殘基與油滴、水的交互作用［25］。

3 結(jié)論

牡蠣水溶性蛋白、鹽溶性蛋白和不溶性蛋白隨胰蛋白酶和堿性蛋白酶水解的進(jìn)行，溶解性呈上升趨勢(shì)，水解時(shí)間越長(DH越大)，溶解性越好。蛋白酶水解對(duì)乳化性的影響與分子大小密功相關(guān)，適當(dāng)水解度可以提高乳化活力，但水解度過大，對(duì)乳化活力起反作用，堿性蛋白酶水解物的水解度較高，對(duì)蛋白乳化性的反作用更大些影響。水溶性蛋白在水解度7%左右時(shí)(反應(yīng)時(shí)間50 min)乳化活力和乳化穩(wěn)定性較好;鹽溶性蛋白經(jīng)胰蛋白酶酶解后水解度在4.4%時(shí)乳化活力較高，經(jīng)堿性蛋白酶酶解后水解度5.8%時(shí)乳化活力高;不溶性蛋白在水解度6%附近時(shí)(反應(yīng)時(shí)間60 min)有較強(qiáng)的乳化活力。

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