孫金旭

（衡水學(xué)院，河北衡水053000）

膽固醇是人體內(nèi)膽汁酸，固醇激素等的前體，它是引起膽結(jié)石和動(dòng)脈粥樣硬化的重要原因之一[1]，因膽固醇對(duì)人類，特別是中老年人的身體健康影響較大，所以人們對(duì)飲食中的膽固醇含量的重視程度很高，如何控制膽固醇的攝入量，各種食品中膽固醇的檢測(cè)更加重要，建立快速、簡(jiǎn)潔的膽固醇測(cè)定方法已迫在眉睫，目前，膽固醇的主要檢測(cè)方法有氣象色譜法（GC）、比色法及其它方法，采用HPLC（高效液相色譜法）測(cè)定食品中的膽固醇含量為我國(guó)現(xiàn)行國(guó)標(biāo)[2-4]，本研究是在對(duì)烤羊肉串前期處理的基礎(chǔ)上，采用HPLC法測(cè)定其中的膽固醇含量，旨在建立烤羊肉串中膽固醇快速、簡(jiǎn)潔的方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

烤羊肉串：市售；膽固醇標(biāo)準(zhǔn)品（購(gòu)于國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)網(wǎng)）。

甲醇、異丙醇、乙腈（色譜級(jí)）購(gòu)于濰坊中匯化工有限公司；無(wú)水乙醇、石油醚、乙醚均為分析純（杭州輝煌化工有限公司）。

1.2 儀器與設(shè)備

Agilent1100高效液相色譜：美國(guó)；EV311旋蒸儀：萊伯泰科有限公司；電子天平：上海田宮稱重制造有限公司。

1.3 樣品處理方法

1.3.1 樣品皂化[5]

精密稱量已經(jīng)切碎的烤羊肉串5 g于500 mL平底燒瓶中，添加60 mL無(wú)水乙醇和20 mL濃度為6 g/mL的KOH溶液，將處理好的樣品置于恒溫磁力攪拌器上皂化回流 1.5 h（300 r/min、150 ℃），結(jié)束后用 10 mL的無(wú)水乙醇沖洗冷凝管，洗液放入平底燒瓶中，冷卻至室溫。

1.3.2 樣品提取

轉(zhuǎn)移經(jīng)皂化后的溶液于500 mL的分液漏斗中，用50 mL水沖洗平底燒瓶并將洗液一并轉(zhuǎn)入分液漏斗中，再用80 mL的乙醚和石油醚（1∶1）混合液分次沖洗平底燒瓶，并將洗液一并轉(zhuǎn)入分液漏斗中，振搖分液漏斗5 min，靜置，待分層后，將分液漏斗中的水相轉(zhuǎn)入另一分液漏斗中，加入80 mL的乙醚和石油醚（1∶1）混合液重復(fù)提取水相2次～3次，合并有機(jī)相，用蒸餾水清洗有機(jī)相至中性，將有機(jī)相轉(zhuǎn)移至300 mL的平底燒瓶中待處理。

1.3.3 提取液濃縮處理

將上述處理后的平底燒瓶中的提取液在45℃條件下，真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干殘?jiān)?，用無(wú)水乙醇溶解殘?jiān)⑥D(zhuǎn)移到10 mL的容量瓶中，無(wú)水乙醇定容至刻度搖勻后微孔過(guò)濾膜過(guò)濾處理后既得。

1.3.4 標(biāo)準(zhǔn)品的制備

精確稱取一定量的標(biāo)準(zhǔn)品，置于50 mL容量瓶中，甲醇溶解并定容，搖勻后待用。

1.3.5 液相色譜測(cè)定條件[6]

色譜柱：C18柱（Agilent公司）；柱溫 35℃；流動(dòng)相：乙腈；流速 1.0 mL/min；進(jìn)樣量 10 μL，檢測(cè)器：紫外檢測(cè)器；檢測(cè)波長(zhǎng)：205 nm；柱壓：48 Pa。

1.3.6 相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差計(jì)算

相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差計(jì)算公式如所示。

1.3.7 回收率計(jì)算

回收率計(jì)算公式如下：

式中：A為回收率；W為原覆烤羊肉串中膽固醇含量，mg；Z為加標(biāo)量，mg；E為加標(biāo)后測(cè)定混合液中膽固醇含量，mg。

2 結(jié)果與討論

2.1 膽固醇標(biāo)準(zhǔn)品HPLC液相色譜圖

膽固醇標(biāo)準(zhǔn)品HPLC色譜測(cè)定條件如下：色譜柱：C18柱（Agilent公司）；柱溫 28℃；流動(dòng)相：乙腈；流速1.0 mL/min；進(jìn)樣量 10 μL，檢測(cè)器：紫外檢測(cè)器；檢測(cè)波長(zhǎng)：205 nm，測(cè)定結(jié)果如圖1所示。

圖1 膽固醇標(biāo)準(zhǔn)品HPLC色譜圖Fig.1 The HPLC spectra for cholesterol standard

由圖1可知，膽固醇標(biāo)準(zhǔn)品在設(shè)定的測(cè)定條件下，在17.386 min處有膽固醇標(biāo)準(zhǔn)峰，表明該測(cè)定條件適宜于膽固醇的測(cè)定。

2.2 繪制膽固醇含量標(biāo)準(zhǔn)曲線

分別取已配置好的膽固醇標(biāo)準(zhǔn)品溶液0、0.5、2、4、6、8、10 mL，分別置于 20 mL 的容量瓶中，用甲醇定容至刻度，搖勻，取10 μL，按上述HPLC測(cè)定條件進(jìn)樣測(cè)定，以峰面積為橫坐標(biāo)，膽固醇標(biāo)準(zhǔn)品濃度（mg/L）為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖2所示。

圖2 標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 The standard curve

如圖2所示，膽固醇標(biāo)準(zhǔn)品峰面積與濃度對(duì)應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Y=78.26x-0. 0025，線性范圍在0 mg/mL～10.0 mg/mL之間，相關(guān)系數(shù)R為0. 9981。

2.3 精密度實(shí)驗(yàn)

取同一供試樣品，經(jīng)微孔過(guò)濾器過(guò)濾后，重復(fù)進(jìn)樣5此，計(jì)算每次膽固醇的出峰時(shí)間和峰面積，結(jié)果如表1所示。

由表1可知，根據(jù)5次測(cè)定時(shí)的出峰時(shí)間及出峰面積計(jì)算得出峰面積RSD為0.52%，保留時(shí)間RSD為0.03%，說(shuō)明此試驗(yàn)設(shè)計(jì)條件精密度良好。

2.4 重現(xiàn)性實(shí)驗(yàn)

取同一羊肉串樣品6份，按所確定的樣品制備方法和色譜條件進(jìn)行膽固醇含量分析，結(jié)果見(jiàn)表2。

表1 峰面積及出峰時(shí)間表Table 1 Peak area and time

表2 重現(xiàn)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 2 Reproducibility of the method

如表2所示，經(jīng)檢測(cè)后的羊肉串樣品膽固醇含量平均值為123.48 mg/100 g，經(jīng)計(jì)算后膽固醇含量的RSD值為0.38%，表明該方法測(cè)定膽固醇含量重現(xiàn)性較好，實(shí)驗(yàn)結(jié)果可靠。

2.5 回收率實(shí)驗(yàn)

取經(jīng)處理好的羊肉串樣品處理液300 mL，平均分為3份，分別測(cè)定其中的膽固醇含量，分別取濃度為20 mg/100 mL的膽固醇標(biāo)準(zhǔn)品10、20、30 mL，分別添加到樣品中，經(jīng)過(guò)濾膜過(guò)濾后分別測(cè)定膽固醇含量，計(jì)算回收率，結(jié)果如表3所示。

表3 樣品回收率表Table 3 The sample recovery

由表3可知，經(jīng)加標(biāo)后，膽固醇標(biāo)品的回收率在98.60%～100.92%之間，表明標(biāo)品回收良好，此方法適宜于烤羊肉串中膽固醇含量的測(cè)定。

2.6 樣品HPLC色譜圖及含量測(cè)定

經(jīng)處理后的樣品按標(biāo)準(zhǔn)品測(cè)定色譜條件進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果如表3所示。

圖3 樣品膽固醇測(cè)定HPLC色譜圖Fig.3 The HPLC spectra for cholesterol in shish kebab

如圖3所示，在設(shè)定的HPLC色譜條件下，樣品測(cè)定的色譜譜圖中，共有10個(gè)峰，前9個(gè)峰分離效果不是太好，但第10個(gè)峰和其它9個(gè)峰分離較好，和膽固醇標(biāo)準(zhǔn)品的色譜圖相對(duì)照，在17.413 min處出的單獨(dú)峰為膽固醇峰，表明此色譜條件較適宜于樣品測(cè)定條件。

取5批樣品經(jīng)處理后，分別精密吸取對(duì)照品溶液和供試品溶液各10 μL，進(jìn)樣后，按上述色譜條件測(cè)定峰面積值，計(jì)算膽固醇含量，結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 烤羊肉串中膽固醇含量測(cè)定表Table 4 The cholesterol content determination in shish kebab

如表4所示，經(jīng)5批樣品測(cè)定后，烤羊肉串中膽固醇含量的平均值為122.75 mg/100 g。

3 結(jié)論

利用HPLC法測(cè)定烤羊肉串中的膽固醇含量，色譜柱：C18柱（Agilent公司）；柱溫 35℃；流動(dòng)相：乙腈；流速1.0 mL/min；進(jìn)樣量10 μL，檢測(cè)器：紫外檢測(cè)器；檢測(cè)波長(zhǎng)：205 nm；柱壓：48 Pa，進(jìn)樣量：10 μL，研究表明：此方法測(cè)定膽固醇含量最大標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.38%，峰面積與膽固醇標(biāo)品線性關(guān)系良好，標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Y=78.26x-0. 0025，相關(guān)系數(shù)R為0. 9981。精密度實(shí)驗(yàn)峰面積RSD為0.52%，保留時(shí)間RSD為0.03%，加標(biāo)回收率在98.60%～100.92%之間，此方法用于測(cè)定烤羊肉串中的膽固醇含量準(zhǔn)確、可行；經(jīng)測(cè)定烤羊肉串中的膽固醇含量平均值為122.75 mg/100 g。

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