劉梁，孫維礦，趙玲，李赫宇，陳新，*

（1.武漢輕工大學生物與制藥工程學院，湖北武漢430023；2.天津市益倍建生物技術有限公司，天津300457）

米糠是一種具有很大潛力的優(yōu)質食品原料，國內外都非常重視米糠的開發(fā)利用[1]。米糠多糖有著很好的生理功能，較強的抗腫瘤和降血清膽固醇功能，對提高免疫力和降低血糖水平等也有一定功效，可用于藥品、保健營養(yǎng)品及化妝品的原料或添加劑，有著較廣闊的應用領域[2-8]。近20年來，對多糖免疫活性的研究是免疫藥理學領域的研究熱點之一[9-10]。前期工作中，我們通過提取、膜分離、醇沉、酶解、冷凍干燥等手段從米糠中提取分離得到不同純度和分子量的米糠多糖 SPK-1、SPK-2、SPK-3、SPK-4。本文主要通過研究以上4種米糠多糖樣品對體外小鼠脾臟淋巴細胞活性的影響，以及樣品對細胞因子IFN-γ，IL-2，IL-10，IL-12，IL-17分泌的影響，考察米糠多糖的免疫增強作用，為進一步揭示 SPK-1、SPK-2、SPK-3、SPK-4 免疫增強作用的機理提供支持。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與試劑

由本實驗室從米糠中分離得到的米糠多糖SPK-1、SPK-2、SPK-3、SPK-4。CCK-8 試劑盒：日本同仁化學；二甲基亞砜（DMSO，分析純）、胎牛血清：FBS，上海玉博生物科技公司；RPMI-1640培養(yǎng)液：青島海博生物技術有限公司；細菌脂多糖：LPS，Sigma公司；刀豆蛋白-A：ConA，Sigma公司。

1.2 儀器和設備

SpectraMax M2e酶標儀：美國Molecular Devices公司；細胞計數板：上海市求精生化試劑儀器有限公司；24、96孔細胞培養(yǎng)板：美國Corning公司；XS204型Mettler Toledo分析天平：瑞士Mettler Toledo公司；HH-2型數顯恒溫水浴鍋：常州國華電器有限公司；CO2培養(yǎng)箱：美國Revco公司；HITACHI-CR22G高速冷凍離心機：日本日立電器公司；UV-5800PC型紫外-可見分光光度計：上海元析儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 米糠多糖樣品溶液的配制及小鼠脾臟淋巴細胞的制備

分別稱取25 mg米糠多糖 SPK-1、SPK-2、SPK-3、SPK-4，用含10%FBS的RPMI-1640培養(yǎng)液溶解并定容到100 mL，過濾除菌后，用含10%FBS的RPMI-1640培養(yǎng)液稀釋至所需濃度，備用。

將C57BL/6小鼠用頸椎脫臼的方法處死，75%酒精浸泡消毒，在無菌條件下取其脾臟，剔除結締組織，先用生理鹽水清洗3次，然后放入含10%FBS的RPMI-1640培養(yǎng)液的培養(yǎng)皿中，用剪刀將脾臟剪成碎片后，用毛玻片輕柔研磨，過200目不銹鋼細胞篩，用含10%FBS的RPMI-1640培養(yǎng)液沖洗網篩，收集濾過的細胞懸液，離心（ 2000 r/min）10 min，棄上清液，用適量含10%FBS的RPMI-1640培養(yǎng)液重懸細胞，臺盼藍染色計數，用含10%FBS的RPMI-1640培養(yǎng)液調整細胞濃度至所需濃度（細胞活率95%以上），備用。

1.3.2 活性測定

1.3.2.1 CCK-8法檢測細胞活力

CCK-8法是用于測定細胞增殖或細胞毒性試驗中活細胞數目的一種高靈敏度，無放射性的比色檢測法。CCK-8被細胞內脫氧酶生物還原后生成的橙色甲瓚染料能夠溶解于組織培養(yǎng)基中，生成的甲臜量與活細胞數量成正比。不同濃度的多糖樣品與小鼠脾臟淋巴細胞體外共培養(yǎng)48 h，考察樣品對淋巴細胞活力的影響作用，觀察樣品是否有細胞毒性或促進細胞的活化及增殖活性。具體操作：小鼠脾臟淋巴細胞（8×105個/孔）接種于96孔板，同時加入不同濃度250、50、10、2、0.4、0.08、0.016 μg/mL 的樣品，對照組樣品濃度為0，并以含10%FBS的1640培養(yǎng)液補至相同體積受試樣品，對照組樣品濃度為0，并以含10%FBS的1640培養(yǎng)液補至相同體積。將培養(yǎng)板放在培養(yǎng)箱中（37℃，5%CO2）培養(yǎng)24或48 h。培養(yǎng)結束前8 h向每孔加入20μL CCK-8溶液。培養(yǎng)結束時，用酶標儀測定450 nm處OD值。

1.3.2.2 絲裂原ConA、LPS誘導脾臟淋巴細胞增殖實驗

常規(guī)制備5×106個/mL脾臟淋巴細胞懸液，于96孔板中每孔加100 μL不同濃度受試樣品，加入50 μL不同濃度受試樣品，同時加入ConA（終濃度5 μg/mL或1 μg/mL）50 μL誘導T淋巴細胞活化增殖，或者LPS（終濃度 10 μg/mL 或 1 μg/mL）50 μL 誘導 B 淋巴細胞活化增殖，另設相應的陽性對照及無刺激本底對照。37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。培養(yǎng)結束前8小時摻入0.25 μCi 3H-thymidine。培養(yǎng)結束后，將培養(yǎng)板凍存于-20℃冰箱，待測。用3H摻入法測定細胞增殖。

1.3.2.3 絲裂原ConA、LPS誘導脾臟淋巴細胞分泌細胞因子

24孔培養(yǎng)板中小鼠脾細胞5×106個/孔，同時加入受試藥物及 ConA（5 μg/mL）或 LPS（10 μg/mL），另設相應刺激對照（僅加入細胞和刺激劑）和無刺激對照（只有細胞，無刺激劑），并加入相應體積含10%FBS的RPMI-1640培養(yǎng)液，終體積2 mL。細胞于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，收集上清液，采用ELISA法檢測上清液中細胞因子濃度。

2 結果與討論

2.1 米糠多糖對小鼠脾臟細胞體外活性的影響

不同濃度的多糖樣品與小鼠脾臟淋巴細胞體外共培養(yǎng)48 h，對淋巴細胞活性的影響如圖1中所示。

圖1 米糠多糖對體外正常小鼠脾臟淋巴細胞活性的影響Fig.1 The influence of rice bran polysaccharide on the activity of spleen lymphocytes of normal mice in vitro

細胞活力=（加藥組OD值-培養(yǎng)液本底對照組OD值）/（溶媒對照組OD值-培養(yǎng)液本底對照組OD值）×100%，細胞活力：＞100%顯示樣品沒有直接的細胞毒性，細胞有活化增殖的現(xiàn)象；＜75%顯示樣品具有細胞毒性作用，影響細胞的存活；control組，溶媒對照；OD值均為酶標儀中自動減去培養(yǎng)液本底對照組OD值后的結果。

實驗運用了CCK-8法檢測了米糠多糖樣品對小鼠脾臟細胞活力影響，實驗結果表明，在未加絲裂原刺激條件下，米糠多糖SPK-1在濃度為250、50、10、2 μg/mL時均對小鼠淋巴細胞有顯著促進增殖作用，SPK-2在濃度為250 μg/mL時對小鼠淋巴細胞有顯著促進增殖作用，SPK-3在濃度為250、50 μg/mL時對小鼠淋巴細胞有顯著促進增殖作用；SPK-4在濃度為250 μg/mL時對小鼠淋巴細胞有顯著促進增殖作用。米糠多糖4個樣品與小鼠淋巴細胞共培養(yǎng)均未見明顯的細胞毒性。

2.2 受試米糠多糖樣品在ConA/LPS分別誘導的脾臟T/B淋巴細胞活化增殖中的影響作用

受試米糠多糖樣品在ConA/LPS分別誘導的脾臟T/B淋巴細胞活化增殖中的影響作用見圖2。

圖2 米糠多糖對ConA誘導的脾臟T淋巴細胞增殖中的影響作用Fig.2 The influence of Rice bran polysaccharide on T lymphocytes proliferationspleen induced by ConA

增強/抑制百分比=（受試樣品組CPM值-刺激對照組CPM值）/（刺激對照組CPM值-細胞對照組CPM值），數值﹥0，說明樣品促進細胞增殖，數值＜0，說明樣品抑制細胞增殖。

在本試驗中，分別檢測了受試樣品在ConA5μg/mL，ConA1μg/mL（低濃度，低水平誘導劑量），LPS10μg/mL，LPS 1 μg/mL（低濃度，低水平誘導劑量）絲裂原誘導的脾臟淋巴細胞活化增殖中的影響作用。試驗結果顯示，受試樣品分別在正常劑量和低劑量的ConA/LPS誘導的小鼠脾臟淋巴細胞活化增殖反應中，分別有輕度的增強或抑制作用，但就每個樣品來看沒有明確的趨向性，即濃度梯度依賴性的影響作用。

圖3 米糠多糖對LPS誘導的脾臟B淋巴細胞增殖中的影響Fig.3 The influence of Rice bran polysaccharide on Spleen B lymphocyte proliferationspleen induced by LPS

2.3 受試樣品對ConA、LPS誘導脾臟淋巴細胞活化分泌細胞因子的影響作用

運用ELISA方法檢測受試米糠多糖樣品對LPS、ConA誘導脾臟淋巴細胞活化分泌IFN-γ，IL-2，IL-10，IL-12，IL-17等細胞因子的影響作用，結果見圖4～7。

圖4 米糠多糖對ConA誘導脾臟淋巴細胞分泌IL-2的影響Fig.4 Effects of rice bran polysaccharide on ConA induced IL-2 secretion of spleen lymphocytes

圖5 米糠多糖對ConA誘導脾臟淋巴細胞分泌IFN-γ的影響Fig.5 Effects of rice bran polysaccharide on ConA induced IFN-γ secretion of spleen lymphocytes

圖6 米糠多糖對LPS誘導脾臟淋巴細胞分泌IL-10的影響Fig.6 Effects of rice bran polysaccharide on LPS induced IL-10 secretion of spleen lymphocytes

圖7 米糠多糖對LPS誘導脾臟淋巴細胞分泌IL-17的影響Fig.7 Effects of rice bran polysaccharide on LPS induced IL-17 secretion of spleen lymphocytes

實驗選取了 25、5、1 μg/mL 3 個濃度的樣品，檢測相應濃度下樣品對ConA、LPS誘導脾臟淋巴細胞活化分泌細胞因子的影響。

白細胞介素-2（IL-2）主要是T淋巴細胞分泌的一種淋巴因子，在機體免疫方面具有重要作用，是一種免疫增強劑，具有抗病毒、抗腫瘤和提高免疫力的作用，我們在實驗中發(fā)現(xiàn) SPK-2（25 μg/mL、1 μg/mL）、SPK-3（25 μg/mL）SPK-4（5 μg/mL）都能夠顯著促進IL-2的分泌。

干擾素-γ（IFN-γ）主要是由活化的T細胞和NK細胞產生，稱為Ⅱ型干擾素，通常由抗原與有絲分裂原誘導產生。干擾素具有抗病毒、抗腫瘤和免疫調節(jié)作用。SPK-1（25 μg/mL，5 μg/mL）、SPK-4（25 μg/mL，5 μg/mL）均能促進ConA誘導小鼠脾臟淋巴細胞分泌IFN-γ；而SPK-4在1 μg/mL的米糠多糖樣品卻顯著抑制了IFN-γ的分泌。

白細胞介素-10（IL-10）是一種多功能負性調節(jié)因子，主要是由Th2細胞、活化的B細胞、單核細胞、巨噬細胞產生，它參與免疫細胞、炎癥細胞、腫瘤細胞等多種細胞的生物調節(jié)。IL-10具有很強免疫抑制及免疫調控作用，IL-10還是某些腫瘤細胞的生長因子，在本試驗中，SPK-3在25 μg/mL濃度下對LPS誘導的小鼠脾臟淋巴細胞分泌IL-10有顯著的促進作用；而SPK-4 在 5 μg/mL，1 μg/mL 濃度下對 IL-10 分泌表現(xiàn)出顯著地抑制作用。

白細胞介素-17（IL-17）是一種前炎癥細胞因子，能夠促進多種細胞釋放炎性因子，與多種炎癥及自身免疫疾病有關。在本試驗中 SPK-2（25、5、1 μg/mL）、SPK-3（5、1 μg/mL）、SPK-4（1 μg/mL）均能顯著抑制ConA誘導小鼠脾臟細胞分泌IL-17的作用。

3 結論

SPK-1：我們采用CCK-8法檢測米糠多糖樣品體外對小鼠脾臟淋巴細胞活性作用影響，發(fā)現(xiàn)在250、50、10、2 μg/mL 濃度時，SPK-1 能顯著促進小鼠脾臟淋巴細胞增殖，且在試驗濃度范圍內沒有表現(xiàn)出顯著地毒性作用。我們用ELISA法檢測該樣品對細胞因子分泌的影響，觀察到樣品在25、5 μg/mL兩個濃度下，能夠顯著促進ConA誘導的小鼠脾臟淋巴細胞分泌IFN-γ。

SPK-2：采用同樣的方法，我們觀察到SPK-2在250 μg/mL時能夠顯著促進小鼠脾臟淋巴細胞增殖；并且SPK-2在25、1 μg/mL濃度時能夠促進ConA誘導的小鼠脾臟淋巴細胞分泌IL-2，且在25、5、1 μg/mL三個濃度下都能明顯抑制ConA誘導的小鼠脾臟淋巴細胞分泌IL-17。

SPK-3：采用同樣的方法，我們觀察到SPK-3在250、50 μg/mL時能夠顯著促進小鼠脾臟淋巴細胞增殖；并且SPK-3在25μg/mL濃度時能夠促進ConA誘導的小鼠脾臟淋巴細胞分泌IL-2以及LPS誘導小鼠細胞分泌IL-10；SPK-3在5、1μg/mL濃度下能夠顯著抑制ConA誘導的小鼠脾臟淋巴細胞分泌IL-17。

SPK-4：采用同樣的方法，我們觀察到SPK-4在250 μg/mL濃度時能顯著促進小鼠脾臟淋巴細胞增殖，SPK-4在5、1 μg/mL能夠顯著促進IL-2的分泌；在 25、5 μg/mL時能顯著促進 IFN-γ的分泌；在5、1 μg/mL時能夠抑制IL-10的分泌；在1 μg/mL時可明顯抑制IL-17分泌。

免疫活性測試結果表明：在CCK-8試驗中，受試的這4種樣品在高濃度狀況下均沒有表現(xiàn)出顯著地細胞毒性，相反，卻表現(xiàn)出顯著的促進細胞增殖的作用，提示我們該系列樣品可能存在免疫促進的作用；另外，在檢測該系列樣品對ConA或LPS誘導的小鼠脾臟淋巴細胞分泌細胞因子時，我們觀察到該系列樣品對IL-2、IFN-γ等細胞因子的分泌存在顯著的促進作用，也顯示相應的樣品具有免疫增強作用。

[1] 胡國華,楊帆,馬正智,等.米糠多糖的研究及應用進展[J].中國食品添加劑,2007(5)：80-85

[2] 王梅,趙鳳敏,劉威,等.米糠多糖的提取、分析及應用[J].中國食物與營養(yǎng),2010(2)：40-43

[3] 姜元榮,姚惠源,王勇,等.米糠多糖BPR及BPR-II對小鼠體外細胞因子分泌的影響研究[J].糧食科技與經濟,2014,4(39)：61-63

[4] 姜元榮,姚惠源,陳正行.米糠多糖的生物活性研究進展[J].食品科技,2002(10)：66-68

[5] 陳明,汪善鋒.米糠多糖的提取工藝及其生物活性的研究進展[J].食品研究與開發(fā),2007,28(6)：173-176

[6] 趙倩,熊善柏,邵小龍,等.米糠多糖的提取及性質和結構[J].中國糧油學報,2008,23(3)：4-7

[7] 汪艷,吳曙光,徐偉,等.米糠多糖抗腫瘤作用及其作用的部分機制[J].中國藥理學通報,1999,15(1)：70-72

[8] 姜元榮,姚惠源,陳正行.堿溶性米糠多糖的提取及其免疫調節(jié)功能研究[J].中國糧油學報,2004：19(6)：1-7

[9] 丘玉昌,吳曙光,徐偉.米糠多糖的提取及免疫調節(jié)作用[J].中國生化藥物雜志,1999,20(2)：91-93

[10]易翠萍,王立,姚惠源.米糠多糖研究進展[J].糧食與油脂,2003(2)：20-22