曹文紅，劉揚(yáng)，洪英燕

（1.廣東省水產(chǎn)品加工與安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東湛江524088；2.廣東普通高等學(xué)校水產(chǎn)品深加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東湛江524088；3.廣東海洋大學(xué)食品科技學(xué)院，廣東湛江524088）

活性氧自由基在體內(nèi)主要有三種形式：·OH、O2-·和H2O2，它們是人體新陳代謝的副產(chǎn)物，可以與生物體內(nèi)的許多物質(zhì)如脂肪酸、蛋白質(zhì)、核酸等作用，造成相關(guān)細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的破壞，在化學(xué)致癌過(guò)程中起著不可忽視的作用[1]。羥自由基·OH是體內(nèi)最活潑的活性氧，攻擊能力最強(qiáng)，對(duì)機(jī)體危害最大，可介導(dǎo)許多病理變化，如引發(fā)不飽和脂肪酸發(fā)生脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，并損傷膜結(jié)構(gòu)及功能，因此羥自由基的檢測(cè)對(duì)于自由基的生物作用研究具有重要意義[2]。眾多研究已證明，氧化損傷與衰老、腫瘤、糖尿病、動(dòng)脈硬化以及人類免疫缺陷病毒（HIV）感染等均有密切關(guān)系。因此，如何清除自由基，防止氧化對(duì)生物體細(xì)胞和組織的破壞得到了普遍關(guān)注。尋找高效、低毒的抗氧化劑一直是近年來(lái)研究者們關(guān)注的課題，抗氧化肽也由此引起了人們的關(guān)注[3]。隨著對(duì)抗氧化的重視和對(duì)活性肽生理功能的認(rèn)識(shí)，利用生物技術(shù)生產(chǎn)抗氧化肽的研究成為了當(dāng)前的熱點(diǎn)。

近幾年來(lái)，國(guó)內(nèi)外研究人員已從不同來(lái)源蛋白質(zhì)中提取到各種具有抗氧化活性的肽類物質(zhì)，如水產(chǎn)蛋白、乳酪蛋白、植物蛋白等[4-6]。特別是水產(chǎn)蛋白是制備抗氧化肽的良好蛋白源，目前已從鮭魚(yú)、鯖魚(yú)、羅非魚(yú)、泥鰍、鯖魚(yú)等眾多水產(chǎn)原料或其加工下腳料的蛋白質(zhì)酶解產(chǎn)物中分離鑒定出具有抗氧化活性的肽類[7]。鳙魚(yú)是我國(guó)四大家魚(yú)之一，其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值雖高，但魚(yú)刺較多，泥腥味重，食用價(jià)值較低，加工利用較少，造成極大浪費(fèi)。研究表明，某些氨基酸如 Glu、Met、Tyr、His、Lys、Pro等具有清除羥自由基的作用，那些表現(xiàn)出較強(qiáng)清除自由基活性的蛋白質(zhì)水解肽，往往分子組成中含有這些氨基酸，而肽的清除自由基活性要強(qiáng)于相應(yīng)的氨基酸[8-9]。楊品紅等在對(duì)幾種鳙魚(yú)肉蛋白質(zhì)進(jìn)行得營(yíng)養(yǎng)成分分析中發(fā)現(xiàn)，Glu、Met、Tyr、His、Lys、Pro 接近占總氨基酸總量40%[10]?？梢灶A(yù)計(jì)，通過(guò)適當(dāng)控制酶解條件，可制備具有較強(qiáng)活性的鳙魚(yú)肉蛋白清除自由基活性肽。本課題以鳙魚(yú)肉為原料，通過(guò)實(shí)驗(yàn)研究比較幾種酶的控制水解效果并比較酶解產(chǎn)物羥清除自由基的特性，篩選蛋白酶進(jìn)行清除羥自由基活性酶解產(chǎn)物的制備，并檢測(cè)其分子量分布，旨在為下一步鳙魚(yú)抗氧化肽分離鑒定提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

鮮活鳙魚(yú)購(gòu)于湛江霞山步行街肉菜市場(chǎng)，經(jīng)去頭、去皮及去內(nèi)臟后將血水和黑膜等清除清洗干凈，切塊后包裝于雙層聚乙烯袋中置于-18℃冷凍備用。

分子量標(biāo)準(zhǔn)：馬尿酰組氨酰亮氨酸（Hippuryl-Histidyl-Leucine，HHL，MW423u）購(gòu)自日本 Peptide Institute；Triosephosphate-isomerase（MW26625u）、Myoglobin （MW16950u）、Aprotinin（MW6512u）、Insulin-B（MW3496u）、Bacitracin（MW1423u）購(gòu)自美國(guó) Biorad公司。

胃蛋白酶（1∶3000）、胰酶（1∶500）購(gòu)自上?；瘜W(xué)試劑公司；堿性蛋白酶Alcalase2.4L（2.4AU/g）購(gòu)自諾維信公司；木瓜蛋白酶（ 300000 U/g）購(gòu)自廣西南寧龐博生物工程有限公司；α-脫氧核糖購(gòu)自美國(guó)Sigma-Aldrich公司；化學(xué)藥品均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

FAT2104型電子分析天平：上海天平儀器廠；HHSZ1-6電熱恒溫水浴鍋：上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠；TD5臺(tái)式離心機(jī)：長(zhǎng)沙英泰儀器有限責(zé)任公司；PHS-25型酸度計(jì)：上海偉業(yè)儀器廠；DS-1型高速組織搗碎機(jī)：上海標(biāo)本模型廠；JD-2型磁力攪拌器：上海理達(dá)儀器廠；UV-2501 PC型紫外分光光度計(jì)：上海尤尼科儀器廠；Waters 600E高效液相液相儀：美國(guó)Waters公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 蛋白酶的篩選

選擇4種蛋白酶，在最適條件下（見(jiàn)表1）對(duì)鳙魚(yú)魚(yú)肉進(jìn)行水解，測(cè)定不同時(shí)間的酶解產(chǎn)物水解度和羥自由基清除活性。

表1 各酶酶解的作用條件Table 1 Enzymatic hydrolysis conditions of the proteases used in enzyme selection

1.3.2 酶解處理

稱量鳙魚(yú)原料20 g→打漿均勻→定容到100 mL→調(diào)pH至設(shè)定值→加入設(shè)定蛋白酶→水浴→滅酶10 min→冷卻后調(diào)節(jié)pH至7.0→ 4000 r/min離心10 min→取上清液→置4℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 水解度的測(cè)定[11]

DH（%）=已水解的肽鍵數(shù)/原料中總肽鍵數(shù)×100%=[（B-C）/（A-D）]×100%

式中：A為原料中總氮量；B為水解液中的氨基氮量；C為原料游離的氨基氮量；D為原料中的非蛋白氮量。

1.3.4 清除羥自由基活性的測(cè)定[12]

取0.2 mL的FeSO4-EDTA混合液（10 mmol/L）于具塞試管中，加入0.2mL的α-脫氧核糖溶液（20mmol/L），然后再加入0.2 mL酶解產(chǎn)物（2 mg/mL），并用磷酸緩沖液（pH 7.4）定容至1.8 mL，最后加入0.2 mL的H2O2（10 mmol/L），37℃水浴保溫1 h，然后加入1 mL 2.8%的三氯乙酸終止反應(yīng)，再加入1 mL 1%的硫代巴比妥，混勻后沸水浴中加熱10 min，冷卻后稀釋5倍于532 nm處測(cè)光吸收值A(chǔ)s。不加樣品，同上操作處理，測(cè)定其對(duì)比吸光值A(chǔ)c。樣品的自由基清除能力（ScavengingActivity，SA）可表示為：SA（%）=（As-Ac）/As。

1.3.6 正交試驗(yàn)法優(yōu)化酶解工藝

為了獲得最高羥自由基清除活性的鳙魚(yú)肉酶解產(chǎn)物，對(duì)酶解溫度、pH、酶量、3個(gè)主要因素進(jìn)行正交優(yōu)化，時(shí)間固定為3 h，底物濃度固定為20%（W/V）。根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果（數(shù)據(jù)未列出）選擇因素水平（見(jiàn)表2），以羥自由基的清除率作為衡量指標(biāo)，利用L9（34）正交表進(jìn)行優(yōu)化實(shí)驗(yàn)。

表2 正交試驗(yàn)因素水平編碼表Table 2 Levels and codes of the factors in the orthogonal design

1.3.7 酶解產(chǎn)物分子量分布的測(cè)定

采用高效體積排阻色譜（HPSEC）法測(cè)定鳙魚(yú)肉最優(yōu)酶解工藝條件的酶解液的分子量分布，流動(dòng)相為50 mmol/L Tris-HCl緩沖液（pH8.3）。將6種分子量標(biāo)準(zhǔn) 多 肽 （Triosephosphate-isomerase、Myoglobin、Aprotinin、Insulin-B、Bacitracin 和 HHL）配制成溶液，上樣10 μL至WatersPROTEIN-PAK 60柱進(jìn)行高效液相色譜洗脫（Waters 600E，美國(guó)Waters公司），流動(dòng)相流速0.7 mL/min，監(jiān)測(cè)214 nm處的吸光值，建立分子量M的對(duì)數(shù)與洗脫保留時(shí)間t之間的回歸方程為分子量。將酶解液經(jīng)過(guò)針式過(guò)濾頭（0.45 μm）過(guò)濾后在相同的條件下進(jìn)行高效液相色譜洗脫，利用分子量回歸方程考察分子量分布。將分子量標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的保留時(shí)間t和分子量的對(duì)數(shù)LgM在平面坐標(biāo)系中描點(diǎn)，回歸得到分子量標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到分子量回歸方程為L(zhǎng)gM=-0. 2261t+6. 4872，決定系數(shù)為0. 9837，說(shuō)明兩者線性相關(guān)性及回歸性良好。

1.3.8 平均肽鏈長(zhǎng)度的計(jì)算

由于蛋白質(zhì)20種氨基酸的平均分子量為128，除去氨基酸與氨基酸縮合成肽鍵時(shí)生成的水分子，即可得平均肽鏈長(zhǎng)度＝分子量大小/（128-18）＝分子量大小/110。

2 結(jié)果與分析

2.1 酶篩選結(jié)果

蛋白酶對(duì)蛋白質(zhì)底物的肽鍵具有一定專一性，因此表現(xiàn)出相同蛋白酶對(duì)不同蛋白質(zhì)的水解效果不同，不同蛋白酶對(duì)相同蛋白質(zhì)的水解效果亦不同。蛋白酶對(duì)蛋白質(zhì)水解的效果則體現(xiàn)在蛋白質(zhì)被水解的程度及水解產(chǎn)物的組成上。水解產(chǎn)物組成的不同又決定了該產(chǎn)物體現(xiàn)的功能特性和生物活性的不同。因此，在活性肽的制備中，酶的篩選及其工藝參數(shù)的確定十分重要。本研究嘗試?yán)蒙锩阜ㄖ苽澉~(yú)肉蛋白清除自由基活性肽，以胃蛋白酶、Alcalase2.4L、木瓜蛋白酶、胰酶等四種4種包括酸性酶、中性酶和堿性酶的動(dòng)物、植物或微生物來(lái)源的蛋白酶進(jìn)行篩選制備用酶。

胃蛋白酶、Alcalase2.4L、木瓜蛋白酶、胰酶4種蛋白酶在酶解時(shí)間2、4、6 h時(shí)的鳙魚(yú)肉酶解產(chǎn)物的羥自由基清除活性及水解度見(jiàn)圖1。

從圖1（a）中可看出，各酶酶解產(chǎn)物均具有一定的羥自由基清除活性。Alcalase2.4L、木瓜蛋白酶、胰酶的鳙魚(yú)肉酶解產(chǎn)物對(duì)羥自由基的清除活性（2 mg/mL濃度下檢測(cè)）比較高，平均在60%以上，而胃蛋白酶的酶解產(chǎn)物清除活性較低，平均40%左右。同時(shí)，由圖1（b）可知木瓜蛋白酶酶解產(chǎn)物水解度最大，平均達(dá)28%，Alcalase2.4L、胰酶酶解產(chǎn)物水解度平均都低于20%，胃蛋白酶酶解產(chǎn)物的水解度平均為12%左右。故通過(guò)本實(shí)驗(yàn)，在羥自由基清除活性相當(dāng)?shù)那闆r下，選擇水解度較大的酶―木瓜蛋白酶作為鳙魚(yú)肉清除羥自由基酶解產(chǎn)物的用酶。當(dāng)水解時(shí)間為2 h時(shí)，清除能力可達(dá)65.78%。各酶酶解產(chǎn)物的水解度和羥自由基清除活性并不隨酶解時(shí)間而提高，未呈規(guī)律性。木瓜蛋白酶是一種內(nèi)切蛋白酶，專一性強(qiáng)，酶解蛋白質(zhì)容易產(chǎn)生短肽[13]。

2.2 木瓜蛋白酶酶解工藝的正交優(yōu)化

正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)可很好地進(jìn)行多因素多水平試驗(yàn)的工藝參數(shù)優(yōu)化，實(shí)現(xiàn)提高活性、得率及降低消耗等研究目的。本研究利用L9（34）的正交試驗(yàn)考察pH、溫度、酶量等對(duì)鳙魚(yú)肉酶解產(chǎn)物羥自由基活性的影響，優(yōu)化木瓜蛋白酶酶解工藝參數(shù)。酶解時(shí)間固定為3 h，底物濃度為20%，考察指標(biāo)為羥自由基清除率。

正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果如表3所示。

表3 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果與分析Table 3 Results and analysis of the orthogonal design

由表中極差分析結(jié)果表明，影響木瓜蛋白酶酶解產(chǎn)物對(duì)羥自由基清除作用的各因素排列順序是C＞A＞B。由正交試驗(yàn)結(jié)果可以得到木瓜蛋白酶酶法制備鳙魚(yú)肉羥自由基清除活性產(chǎn)物的優(yōu)化酶解條件是A1B1C2，確定的最佳優(yōu)化條件為：45℃，pH 7.0，酶加量2%，時(shí)間3 h，底物濃度20%。在該條件下，鳙魚(yú)肉酶解物的羥自由基清除率達(dá)76.13%（2 mg/mL）。這表明經(jīng)過(guò)水解之后，鳙魚(yú)肉酶解產(chǎn)物對(duì)自由基表現(xiàn)出較好的清除效果，提示酶解產(chǎn)物中存在較強(qiáng)的羥自由基清除活性物質(zhì)。

2.3 酶解產(chǎn)物的分子量分布

蛋白質(zhì)酶解產(chǎn)物的分子量分布可反映其組成情況。HPSEC已經(jīng)成功地應(yīng)用于果膠、寡聚半乳糖醛酸等多糖及其衍生物的分子質(zhì)量測(cè)定，它能分離相對(duì)分子質(zhì)量差別在10%以上的分子[14]。蛋白質(zhì)酶解產(chǎn)物組分相對(duì)分子質(zhì)量的變化是連續(xù)的，雖不能用HPSEC進(jìn)行分離，但可測(cè)定其相對(duì)分子質(zhì)量的分布情況。

在正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)的優(yōu)化條件下制備木瓜蛋白酶鳙魚(yú)肉的酶解產(chǎn)物下進(jìn)行HPSEC分析，如圖2所示。

圖2 鳙魚(yú)肉木瓜蛋白酶酶解產(chǎn)物HPSEC圖譜Fig.2 HPSEC of the papain hydrolysate of variegated carp meat under optimized condition

在紫外波長(zhǎng)214 nm條件下得到9個(gè)主要的吸收峰。根據(jù)分子量分布，峰1、峰2和峰3的肽鏈長(zhǎng)度在294.2～51.1之間，該組分主要是蛋白質(zhì)。峰8和峰9組分主要是小肽和氨基酸，平均肽鏈長(zhǎng)分別為4.0～2.3，2.3～0.3。而峰 4 肽鏈長(zhǎng)度為 51.1～24.5，峰 5、6、7 組分的肽鏈長(zhǎng)度在24.5～4.0之間。峰5至峰9這部分組分（2691～32 u）占酶解產(chǎn)物的65%，這表明鳙魚(yú)肉酶解產(chǎn)物中具有較強(qiáng)羥自由基清除活性的主要是短肽產(chǎn)物（表4）。

表4 用于鳙魚(yú)肉木瓜蛋白酶酶解產(chǎn)物的分子量分布Table 4 Molecular weight distribution of the papain hydrolysate of variegated carp meat

3 結(jié)論

1）利用胃蛋白酶、Alcalase2.4L、木瓜蛋白酶、胰酶4種常用蛋白酶制備鳙魚(yú)肉酶解液，測(cè)定酶解時(shí)間2、4、6 h時(shí)的鳙魚(yú)肉酶解產(chǎn)物對(duì)羥自由基的清除活性和水解度，其中木瓜蛋白酶酶解效果最好，其水解度平均達(dá)28%，羥自由基清除率平均達(dá)65.78%。

2）通過(guò)對(duì)酶解溫度、pH、酶量3個(gè)主要因素進(jìn)行正交優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)，得到鳙魚(yú)肉酶解液清除羥自由基活性最佳酶解工藝條件為：木瓜蛋白酶用量2%，溫度為45℃，pH為7.0，酶解時(shí)間為3 h，底物濃度20%，在該條件下羥自由基清除率為76.13%。

3）利用木瓜蛋白酶酶解鳙魚(yú)肉制備具有較高活性的清除羥自由基活性酶解產(chǎn)物，經(jīng)高效體積排阻色譜分離，得到9個(gè)吸收峰。分子量分布范圍2691～32 u的組分占酶解產(chǎn)物的65%，表明鳙魚(yú)肉酶解產(chǎn)物中具有清除羥自由基清除活性的主要是短肽產(chǎn)物。

[1] 孫存普,張建中,段紹瑾,等.自由基生物學(xué)導(dǎo)論[M].合肥：中國(guó)科學(xué)技術(shù)出版社,1999

[2] 祁克宗,王林安.自由基和生物抗氧化系統(tǒng)理論與外科學(xué)的關(guān)系[J].安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),1996,23(2)：171-174

[3] 薛照輝,吳謀成,羅祖友,等.菜籽肽清除自由基作用的研究[J].食品工業(yè)科技,2005,26(10)：71-75

[4] Kumar N S,Nazeer R A,Jaiganesh R.Purification and biochemical characterization of antioxidant peptide from horse mackerel(Magalaspiscordyla)viscera protein[J].Peptides,2011,32(7)：1496-1501

[5] Zhang T,Li Y,Miao M,et a1.Purification and characterisation of a new antioxidant peptide from chickpea (Cicer arietium L.)protein hydrolysates[J].Food Chemistry,2011,128(1)：28-33

[6] Chen M,Li B.The effect of molecular weights on the survivability of casein-derived antioxidant peptides after the simulated gastrointestinal digestion[J].Innovative Food Science&Emerging Technologies,2012,16：341-348

[7] ChalamaiahM,Kumar B D,Hemalatha R,et al.Fish protein hydrolysates：Proximate composition,amino acid composition,antioxidant activities and applications：A review[J].Food Chemistry,2012,135(4)：3020-3038

[8] Chen H M,Muramoto K,Yamauchi F.Antioxidant activity of designed pep tides based on the antioxidative pep tide isolated from digests of a soybean peptide[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry,1996,44：2619-2623

[9] Chen H M,Muramoto K,Yamauchi F.Antioxidative properties of histidine-containing peptides designed from peptide fragments found in the digests of a soybean protein[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry,1998,46：49-53

[10]楊品紅,王志陶,夏德斌,等.黑花鳙(Aristichthys nobilis)和白花鳙肌肉營(yíng)養(yǎng)成分分析及營(yíng)養(yǎng)價(jià)值評(píng)定[J].海洋與湖沼,2010,41(4)：549-554

[11]Adler-Nissen J.Enzymic hydrolysis of food proteins[M].London：Elsevier Applied Science Publishers,1986,13-14

[12]Mendis E,Rajapakse N,Byun H G.Investigation of jumbo squid(Dosidicus gigas)skin gelatin peptides for their in vitro antioxidant effects.Life Sciences,2005,77(17)：2166-2178

[13]李艷伏,徐懷德,陳金海,等.木瓜蛋白酶酶解核桃粕蛋白產(chǎn)物抗氧化活性研究[J].中國(guó)食品學(xué)報(bào),2008,8(5)：8-14

[14]戴軍,陳尚衛(wèi),朱松,等.不同來(lái)源靈芝孢子粉的多糖分子量分布分析與比較[J].食品與機(jī)械,2010,26(1)：12-14