曾 凱，王 永，陳美華，歐陽(yáng)秋芳(福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬福建省第二人民醫(yī)院心內(nèi)科，福州 350003;福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬福建省第二人民醫(yī)院超聲科;通訊作者，E-mail:fjzengkai@6.com)

冠脈微栓塞(coronary microembolization，CME)是臨床上十分常見(jiàn)的病理生理過(guò)程，嚴(yán)重地影響患者的心功能及預(yù)后。CME的本質(zhì)是心肌微小血管栓塞及微循環(huán)灌注障礙［1］，故更有針對(duì)性的干預(yù)切入點(diǎn)應(yīng)是恢復(fù)心肌組織的血流灌注?；謴?fù)血流灌注常用的方法主要有各種干細(xì)胞移植、各種生長(zhǎng)因子干預(yù)及某些藥物刺激等。上述方法有別于外科搭橋手術(shù)及其他血管重建術(shù)，但其目標(biāo)仍然是重建有效心肌血供，故被形象的稱為“誘導(dǎo)性心臟自身搭橋”或“治療性心肌血管再生”［2］。

動(dòng)物試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)他汀類藥物具有促血管再生及改善心肌微循環(huán)的效應(yīng)［3］。血管再生包括血管再生(angiogenesis)和血管發(fā)生(vasculogenesis)，他汀類對(duì)這兩個(gè)過(guò)程均有重要的影響［4］;他汀類改善心肌微循環(huán)障礙主要是繼發(fā)于甲烴戊酸通路的中間產(chǎn)物異戊烯類的生物合成減少，甲烴戊酸的合成減少可以使Akt(絲氨酸-蘇氨酸激酶)磷酸化而激活，從而使eNOs活性和穩(wěn)定性增加，使心肌NO的水平升高［5］?；诖思僭O(shè)，本實(shí)驗(yàn)擬建立一種穩(wěn)定的大鼠CME模型，旨在探討辛伐他汀干預(yù)對(duì)CME后心肌微小血管保護(hù)與微小血管再生的影響及可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)SD大鼠40只，雌性，體重(300±20)g，由福建醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及實(shí)驗(yàn)步驟符合國(guó)家實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例。

1.2 實(shí)驗(yàn)材料

辛伐他汀原藥粉(廣州南新公司)，NO試劑盒(南京建成生物醫(yī)學(xué)工程研究所)，Ⅷ因子相關(guān)抗原多克隆抗體，PE、TRITC標(biāo)記的山羊抗大鼠的二抗(北京中山生物技術(shù)有限公司)，鹽酸氯胺酮(江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器

TKR-200C小動(dòng)物呼吸機(jī)由江西省特力麻醉呼吸設(shè)備公司提供;多功能生理記錄儀BL-420E型由成都泰盟儀器廠提供，GE SYSTEMⅤ超聲心動(dòng)圖儀及5-MHZ多平面經(jīng)食道超聲探頭由美國(guó)GE公司提供;IMAGE PRO 4.0顯微鏡結(jié)合計(jì)算機(jī)顯微圖像分析系統(tǒng)由日本Olympus公司提供。

1.4 研究方法

1.4.1 CME模型建立 選用SPF級(jí)大鼠，從每只尾靜脈取血2 ml凝固成血栓，CS501-3C恒溫箱37℃過(guò)夜烘干，后取玻璃研磨器研磨，38 μm濾網(wǎng)濾過(guò)使之成為較均勻顆粒。電子天平稱重8 mg血栓顆粒供每只動(dòng)物實(shí)驗(yàn)備用。次日在大鼠腹腔注射戊巴比妥鈉50 mg/kg麻醉后，取仰臥位，術(shù)區(qū)備皮消毒，氣管插管，呼吸機(jī)輔助通氣。取第2肋間水平橫切口，剪斷胸骨，切開(kāi)心包，暴露主動(dòng)脈根部，取已稱好的血栓顆粒溶于0.5 ml生理鹽水中，用1 ml注射針桶吸取血栓懸浮液，使用直徑0.5 mm細(xì)針刺入心尖部，同時(shí)鉗夾升主動(dòng)脈，10 s后松開(kāi)鉗夾的升主動(dòng)脈，壓迫穿刺口止血，關(guān)胸復(fù)蘇。為防止動(dòng)物術(shù)后感染，每天肌注青霉素40萬(wàn)U/只，連續(xù)3 d。

1.4.2 分組及干預(yù)方案 40只大鼠隨機(jī)分成5組:對(duì)照組(C組)、假手術(shù)組(sham組)、CME模型組(M組)、辛伐他汀干預(yù)組(ST組)及辛伐他汀加N-硝酸-L-精氨酸甲酯(L-NAME)干預(yù)組(STN組)，全部模型均制作成功，每組各8只動(dòng)物。干預(yù)方案:ST組CME模型制備后，以辛伐他汀2 mg/kg/d，用生理鹽水稀釋到5 ml灌胃，每日一次。STN組:模型制備后，以辛伐他汀2 mg/(kg·d)加N-硝酸-L-精氨酸甲酯15 mg/(kg·d)用生理鹽水稀釋到5 ml灌胃，每日一次。M組:模型制備后，予生理鹽水灌胃，每日一次，一次5 ml。sham組:手術(shù)方法同M組，自心尖部注入生理鹽水替代血栓微粒，術(shù)后予生理鹽水灌胃，每日一次，一次5 ml。C組:未手術(shù)大鼠，予生理鹽水灌胃，每日一次，一次5 ml。所有動(dòng)物均在飼養(yǎng)28 d處死。

1.4.3 主要指標(biāo)檢測(cè) 采用Ⅷ因子染色評(píng)定單位面積心肌微小血管的密度，免疫熒光檢測(cè)單位面積心肌微小血管的數(shù)量，采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)測(cè)定心肌組織勻漿NO含量。嚴(yán)格按照使用說(shuō)明書進(jìn)行操作。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 不同組別微小血管密度的變化

Ⅷ因子染色結(jié)果顯示，術(shù)后28 d，sham組與C組比較，微小血管密度差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。M組與sham組比較，微小血管密度明顯減少(P＜0.01)。ST組與M組比較，微小血管密度明顯增加(P＜0.01);STN組與ST組比較，微小血管密度顯著減少(P＜0.01，見(jiàn)表1)。C組及sham組心肌微小血管密度正常，M組心肌微小血管密度明顯降低，ST組辛伐他汀干預(yù)后心肌微小血管密度明顯多于M組，STN組L-NAME干預(yù)后心肌微小血管密度較ST組減少(圖1，見(jiàn)第160頁(yè))。

表1 冠脈微栓塞后心肌內(nèi)微小血管密度、微小血管數(shù)量、NO含量比較及辛伐他汀干預(yù)的影響(±s)Table 1 Density of micro-vessel，num ber of micro-vessel and level of NO in myocardium after coronary microembolization and the invention effect of simvastatin(±s)

表1 冠脈微栓塞后心肌內(nèi)微小血管密度、微小血管數(shù)量、NO含量比較及辛伐他汀干預(yù)的影響(±s)Table 1 Density of micro-vessel，num ber of micro-vessel and level of NO in myocardium after coronary microembolization and the invention effect of simvastatin(±s)

與C組和sham比較，*P＜0.01;與 M組比較，#P＜0.01;與 ST組比較，ΔP ＜0.01

組別 n 微小血管密度/(/mm2)微小血管數(shù)量/(/mm2)NO含量/(mmol/kg)C組8 7.25 ±0.27 0 27.70 ±1.03 sham 組 8 7.32 ±0.19 0 27.75 ±1.28 M組 8 3.32 ±0.16*1.30 ±0.15* 20.87 ±2.23*ST 組 8 5.05 ±0.24#4.49 ±0.57# 26.37 ±1.30#STN 組 8 3.59 ±0.42Δ 3.28 ±0.22Δ 15.38 ±1.41Δ

2.2 不同組別微小血管數(shù)量的變化

免疫熒光結(jié)果顯示，ST組與M組比較，微小血管數(shù)量明顯增加(P＜0.01)，STN組與ST組比較，微小血管數(shù)量顯著減少(P＜0.01，見(jiàn)表1)。

與M組相比，ST組辛伐他汀干預(yù)后心肌新生微小血管明顯增多，STN組L-NAME干預(yù)后心肌新生微小血管較ST組減少(圖2，見(jiàn)第161頁(yè))。

圖1 冠脈微栓塞后心肌內(nèi)微小血管密度比較及辛伐他汀干預(yù)的影響(HE染色，bar=100 μm)Figure 1 Effect of simvastatin on density of micro-vessel in myocardium after coronary microembolization (HE，bar=100 μm)

圖2 冠脈微栓塞后心肌內(nèi)微小血管數(shù)量比較及辛伐他汀干預(yù)的影響(免疫熒光染色×100)Figure 2 Effect of simvastatin on number of micro－vessel in myocardium after coronary microembolization(immunofluorescence，×100)

2.3 不同組別心肌組織勻漿NO含量的變化

術(shù)后28 d，sham組與C組比較NO含量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);M組與sham組比較，NO含量顯著下降(P＜0.05);ST組與M組比較，NO含量顯著增加(P＜0.01)。STN組與ST組比較，NO含量顯著下降(P ＜0.01，見(jiàn)表1)。

3 討論

引起CME的常見(jiàn)原因有斑塊自發(fā)破裂、經(jīng)皮冠脈介入治療(PCI)術(shù)中機(jī)械損傷致斑塊破裂、溶栓術(shù)中血栓溶解不全等，CME嚴(yán)重時(shí)可引起患者猝死［1，2］。CME發(fā)生后慢性過(guò)程中心功能仍然持續(xù)性或進(jìn)行性惡化［6］。因此，尋找CME后慢性過(guò)程中有效的干預(yù)措施顯然十分重要。

他汀類藥物是當(dāng)前最強(qiáng)效的降低血清膽固醇或LDL-C的藥物，臨床廣泛應(yīng)用于高膽固醇血癥的治療及冠心病的一級(jí)、二級(jí)預(yù)防。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，術(shù)后28 d，辛伐他汀組與模型組比較，心肌內(nèi)微小血管密度和新生微小血管數(shù)量明顯增加。初步證實(shí)了CME后辛伐他汀干預(yù)可減少心肌微小血管的破壞并增加心肌微小血管及毛細(xì)血管的再生。大量研究表明，他汀類藥物可促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞釋放NO，從而達(dá)到保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞的作用。本研究也進(jìn)一步證實(shí)，經(jīng)辛伐他汀處理的動(dòng)物其心肌組織中的NO含量明顯升高。NO與內(nèi)皮細(xì)胞的遷移關(guān)系密切［7］，NO還可以促進(jìn)內(nèi)皮祖細(xì)胞表面整合素的表達(dá)，整合素可支持血管細(xì)胞建立的新血管，這在微血管再生中起到關(guān)鍵性的作用［8］;同時(shí)，NO也可以動(dòng)員骨髓內(nèi)皮祖細(xì)胞，增加循環(huán)EPCs數(shù)目，促進(jìn)微血管的發(fā)生［9］。NO為血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)的下游效應(yīng)器，有調(diào)節(jié)血管VEGF促血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖作用［10］。因此，他汀刺激NO的釋放可能就是通過(guò)上述機(jī)制發(fā)揮促進(jìn)血管新生的作用。

L-NAME是NO的特異性阻斷劑之一，我們的研究結(jié)果證實(shí)，經(jīng)L-NAME處理的動(dòng)物，辛伐他汀對(duì)CME后新生血管生成的促進(jìn)作用部分消失，進(jìn)一步表明辛伐他汀可能是通過(guò)NO介導(dǎo)的信號(hào)通路來(lái)發(fā)揮促進(jìn)血管新生作用的。

綜上所述，辛伐他汀可增加冠脈微栓塞后心肌內(nèi)微小血管密度和新生微小血管數(shù)量，而這種作用可能是通過(guò)NO介導(dǎo)的。

［1］Su Q，Li L，Liu YC，et al.Effect of metoprolol on myocardial apoptosis and caspase-9 activation after coronary microembolization in rats［J］.Exp Clin Cardiol，2013，18(2):161-165.

［2］Chen Z，Qian J，Ma J，et al.Glucocorticoid ameliorates early cardiac dysfunction after coronary microembolization and suppresses TGF-β1/Smad3 and CTGF expression［J］.Int J Cardiol，2013，167(5):2278-2284.

［3］Asai J，Takenaka H，Hirakawa S，et al.Topical simvastatin accelerates wound healing in diabetes by enhancing angiogenesis and lymphangiogenesis［J］.Am J Pathol，2012，181(6):2217-2224.

［4］Shimada T，Takeshita Y，Murohara T，et al.Angiogenesis and vasculogenesis are impaired in the precocious-aging klotho mouse［J］.Circulation，2004，110(9):1148-1155.

［5］Scalia R，Gooszen ME，Joines SP，et al.Simvastatin exerts both anti-inflammatory and cardioprotective effect in apolipoprotein E-deficient mice［J］.Circulation，2001，103(21):2598-2603.

［6］Otto S，Seeber M，F(xiàn)ujita B，et al.Microembolization and myonecrosis during elective percutaneous coronary interventions in diabetic patients:an intracoronary Doppler ultrasound study with 2-year clinical follow-up［J］.Basic Res Cardiol，2012，107(5):289-294.

［7］Marcelo KL，Goldie LC，Hirschi KK.Regulation of endothelial cell differentiation and specification ［J］.Circ Res，2013，112(9):1272-1287.

［8］Vaiyapuri S，Hutchinson EG，Ali MS，et al.Rhinocetin，a venomderived integrin-specific antagonist inhibits collagen-induced platelet and endothelial cell functions［J］.J Biol Chem，2012，287(31):26235-26244.

［9］Mourino-Alvarez L，Calvo E，Moreu J，et al.Proteomic characterization of EPCs and CECs“in vivo”from acute coronary syndrome patients and control subjects［J］.Biochim Biophys Acta，2013，1830(4):3030-3053.

［10］Follin B，Tratwal J，Haack-S rensen M，et al.Identical effects of VEGF and serum-deprivation on phenotype and function of adipose-derived stromal cells from healthy donors and patients with ischemic heart disease［J］.J Transl Med，2013，11(1):219.