邵 理，詹 萍，田洪磊

(石河子大學食品學院，新疆石河子832000)

昆侖雪菊(Coreopsis tinctoria Nuff.)是菊科金雞菊屬一年生草本植物，其學名為蛇目菊、雙色金雞菊［1］。原產(chǎn)地為美國中西部地區(qū)，目前在新疆和田地區(qū)廣泛種植，在當?shù)赜址Q之為雪菊、昆侖血菊、高寒雪菊等，維語名稱為古里恰依［2］。也是目前在新疆唯一可以與雪蓮媲美，具有特殊功效和藥用價值的高寒野生植物［3］。昆侖雪菊味甘，性平，具有活血化瘀、和胃健脾、降血壓和降血脂的作用。長期以來都被當?shù)鼐用癞敾ú鑱盹嬘?，并有減肥養(yǎng)顏、抗菌消炎的功效，具有極高的藥用價值，歷代藥典中關于昆侖雪菊的藥用價值記載也很多，因此昆侖雪菊是具有廣闊前景和研究價值的新品種［4-7］。

近幾年來，隨著人們對天然產(chǎn)物保健品越來越重視，加之植物多糖類化合物有著廣泛的生物活性(如免疫調(diào)節(jié)、降血糖、抗氧化等)作用，引起了許多學者對多糖的關注和研究?，F(xiàn)代藥理研究已表明菊花多糖是一種良好的氧自由基清除劑，具有良好的預防保健作用［8］。昆侖雪菊的藥理作用［9-10］，及其氨基酸［11］、總黃酮［3］、揮發(fā)油［12］等化學成分的研究已有報道，但對其多糖的研究報道尚待深入。本論文以多糖得率為指標，結(jié)合超聲波輔助提取及響應面實驗Box-Behnken設計的方法，探討了液料比、超聲時間、提取溫度等參數(shù)對昆侖雪菊多糖得率的影響。預期研究成果為新疆昆侖雪菊生物活性物質(zhì)制備提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

昆侖雪菊 西域金鋤生物工程有限責任公司提供;苯酚、硫酸、乙醇、葡萄糖等標品及其他試劑 均為分析純，蒸餾水為實驗室自制。

雙頻數(shù)控超聲波清洗器KQ-200VDE 昆山市超聲儀器有限公司;紫外可見分光光度計UVmini-1240 島津國際貿(mào)易公司;離心機 力康發(fā)展有限公司;粉碎機 上海百豐食品機械有限公司;HHS-216型恒溫水浴槽 常州國華電器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 昆侖雪菊多糖的提取方法 參考文獻［13］，將昆侖雪菊放入40℃的烘箱中干燥24h，粉碎，過60目篩，密封后避光保存。采用索氏提取法在有機溶劑丙酮-石油醚(1∶1，V/V)65℃的回流下對昆侖雪菊粉末進行脫脂處理，并烘干脫脂后的粉末。再進行超聲萃取處理，經(jīng)提取，離心合并上清液并濃縮后，用Sevag法除蛋白、醇沉、抽濾，濾餅依次用無水乙醇、丙酮、乙醚洗滌后，真空干燥，得昆侖雪菊粗多糖。其工藝流程:昆侖雪菊→干燥→粉碎→脫脂→超聲波萃取→離心→濃縮→去蛋白→醇沉→洗滌→冷凍干燥→粗多糖。

1.2.2 標準曲線的建立 參考文獻［14-15］，分別吸取(1.0mg/mL)葡萄糖標準溶液 2.0、4.0、6.0、8.0、10.0mL，分別置100mL容量瓶中，用蒸餾水稀釋至刻度，搖勻。精密移取上述系列標準溶液各0.5mL，置于具塞玻璃試管(10mL)中，空白對照用蒸餾水0.5mL。每管加入1.0mL苯酚溶液(5%)，混勻后，加3.5mL濃硫酸，迅速混勻，室溫放置10min，置40℃水浴中加熱反應30min，冰水浴冷卻至室溫，于487nm處測吸光度。以標準葡萄糖濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標，繪制標準曲線?；貧w方程為:A=0.0072C-0.002，R2=0.9981(n=5)，線性關系良好。式中:A表示波長487nm處的吸光度;C表示葡萄糖的濃度。

1.2.3 苯酚-硫酸法測定昆侖雪菊多糖的得率 昆侖雪菊多糖的得率(%)=C×V×D/W×100，式中:C為根據(jù)標準曲線計算出的濃度，μg/mL;V為提取液的體積，mL;D為樣品溶液的稀釋倍數(shù);W為樣品的質(zhì)量，μg。

1.2.4 單因素實驗

1.2.4.1 液料比對昆侖雪菊多糖得率的影響 準確稱取昆侖雪菊粉末2.00g，設置超聲時間為60min、提取次數(shù)為一次、提取溫度為70℃，分別在液料比(mL/g)梯度為 20∶1、30∶1、40∶1、50∶1、60∶1、70∶1 條件下制備粗多糖樣品，并結(jié)合離心、醇沉及洗滌等環(huán)節(jié)對制備粗液進行純化。通過樣品復溶稀釋測定吸光值，計算昆侖雪菊多糖的得率。

1.2.4.2 超聲時間對昆侖雪菊多糖得率的影響 準確稱取昆侖雪菊粉末2.00g，設置液料比(mL/g)40∶1、提取次數(shù)為一次、提取溫度為70℃，分別在超聲時間為 15、30、45、60、75、90min 條件下制備粗多糖樣品，并結(jié)合離心、醇沉及洗滌等環(huán)節(jié)對制備粗液進行純化。通過樣品復溶稀釋測定吸光值，計算昆侖雪菊多糖的得率。

1.2.4.3 提取次數(shù)對昆侖雪菊多糖得率的影響 準確稱取昆侖雪菊粉末2.00g，設置液料比(mL/g)40∶1、超聲時間為60min、提取溫度為 70℃，分別在提取次數(shù)為一次、兩次、三次、四次、五次條件下制備粗多糖樣品，并結(jié)合離心、醇沉及洗滌等環(huán)節(jié)對制備粗液進行純化。通過樣品復溶稀釋測定吸光值，計算昆侖雪菊多糖的得率。

1.2.4.4 提取溫度對昆侖雪菊多糖得率的影響 準確稱取昆侖雪菊粉末2.00g，設置液料比(mL/g)40∶1、超聲時間為60min、提取次數(shù)為一次，分別在提取溫度為30、40、50、60、70、80℃ 條件下制備粗多糖樣品，并結(jié)合離心、醇沉及洗滌等環(huán)節(jié)對制備粗液進行純化。通過樣品復溶稀釋測定吸光值，計算昆侖雪菊多糖的得率。

1.2.5 響應面分析法優(yōu)化實驗驗 根據(jù)Box-Benhnken的中心組合實驗設計原理［16］，結(jié)合前期單因素實驗，選取液料比、超聲時間、提取溫度、提取次數(shù)各因素的最優(yōu)實驗范圍，以多糖得率(%)為響應值，運用響應面法進行四因素三水平的昆侖雪菊多糖提取工藝優(yōu)化實驗設計，以確定昆侖雪菊多糖最佳提取工藝。因素水平及編碼如表1所示。

表1 響應面因素水平及編碼Table 1 The factors and levels of response surface

1.2.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析 數(shù)據(jù)采用origin8.0及Design-Expert 8.06軟件處理分析，所有數(shù)據(jù)均進行三次平行實驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實驗

2.1.1 液料比對昆侖雪菊多糖得率的影響 從圖1可以看出，液料比在(mL/g)20∶1～50∶1 之間，多糖的得率隨溶劑量的增加而增大，在50∶1時多糖得率達到最大，當進一步增大液料比時，多糖的得率反而下降。在一定范圍內(nèi)，由于萃取體系溶劑量的增加會導致溶質(zhì)細胞內(nèi)外滲透壓產(chǎn)生明顯差異，從而在加速多糖擴散程度的同時，輔助于多糖浸出效率的提升;隨著細胞內(nèi)外多糖濃度趨向平衡的動態(tài)變化，多糖溶出量達到最大［17］;繼而增大液料比，可能會加速胞內(nèi)其它物質(zhì)浸出及多糖螯合的機率，致使多糖得率降低。故選取液料比(mL/g)50∶1左右為宜。

2.1.2 超聲時間對昆侖雪菊多糖得率的影響 從圖2可以看出，超聲時間在15～45min之間，多糖得率隨超聲時間延長而逐漸增加，45min時多糖得率達到最大，而后隨時間的延長得率呈下降趨勢。由于超聲波剪切力強和對細胞的空化作用，使得細胞內(nèi)部的多糖逐漸向外擴散，得率呈上升趨勢;當處理數(shù)分鐘后，細胞破碎程度增大，有利于多糖浸出，多糖的含量升高到最大值;隨超聲波處理時間的延長，多糖結(jié)構(gòu)遭到破壞，這可能是造成得率下降的原因［18］。故選取超聲時間45min左右為宜。

圖1 液料比對多糖得率的影響Fig.1 The influence of liquid-solid ratio on polysaccharide yield

圖2 超聲時間對多糖得率的影響Fig.2 The influence of ultrasound time on polysaccharide yield

2.1.3 提取次數(shù)對昆侖雪菊多糖得率的影響 從圖3可以看出，隨著提取次數(shù)的增加，得率增加基本平緩。一次提取，整個體系較稠，溶液顏色較深，多糖不能完全浸出。提取次數(shù)增加，得率變化不大，所得溶液的體積增加，為后期溶液的處理帶來試劑上的浪費。故選取提取次數(shù)為兩次左右為宜。

圖3 提取次數(shù)對多糖得率的影響Fig.3 The influence of extraction times on polysaccharide yield

2.1.4 溫度對昆侖雪菊多糖得率的影響 從圖4可以看出，在30～60℃范圍內(nèi)，多糖得率呈上升趨勢，在60℃時，得率達到最大，而后隨著溫度升高多糖得率呈降低趨勢。溫度升高，使得多糖分子擴散運動加強，促使多糖浸出，多糖得率增加;然而在溫度過高的情況下，可能由于多糖糖苷鍵的破壞與降解，導致多糖得率下降。故選取提取溫度60℃左右為宜。

圖4 溫度對多糖得率的影響Fig.4 The influence of extraction temperature on polysaccharide yield

2.2 響應面分析法優(yōu)化實驗

2.2.1 回歸模型的建立及方差分析 采用Design Expert8.0.6軟件中的Box-Behnken模型設計分析方案，實驗設計及結(jié)果如表2所示。

表2 響應面實驗設計及結(jié)果Table 2 The experimental scheme and results of central composite design

表3 回歸模型及方差分析結(jié)果Table 3 The regression models and results of variance analysis

根據(jù)表2中Box-Behnken實驗設計結(jié)果，采用Design-Expert 8.06統(tǒng)計軟件，通過回歸分析對表2實驗數(shù)據(jù)進行回歸擬合，得到A(液料比)、B(超聲時間)、C(提取次數(shù))、D(溫度)四個因素對昆侖雪菊多糖得率(Y)的二次回歸方程為:

Y=+11.82+0.65A+0.35B+0.16C-0.63D-0.43AB-1.07AC+0.48AD-0.62BC-0.16BD+1.00CD-1.35A2-1.94B2-0.79C2-0.74D2。對該回歸模型及其系數(shù)進行顯著性檢驗，結(jié)果見表3。

由表3可知:模型極顯著(p＜0.0001)，一次項(A、B、D)、交互項(AC、BC、CD)、各平方項均對響應值有極顯著性影響;失擬項p=0.9893＞0.05，失擬項差異不顯著，該回歸方程對實驗擬合程度較好;模型相關系數(shù)為0.9705，說明該模型能解釋97.05%的響應值變化，僅有2.95%的變異不能由此模型解釋，預測值與實驗值具有高度的相關性，該模型成立。對回歸系數(shù)顯著性檢驗，在α=0.05顯著水平剔除不顯著項，得到優(yōu)化后的方程為:

通過對回歸系數(shù)的檢驗可知，各因素對昆侖雪菊多糖得率影響的大小順序為A(液料比)＞D(溫度)＞B(超聲時間)＞C(提取次數(shù))，其中液料比、溫度、超聲時間對得率具有極顯著的影響，提取次數(shù)對得率沒有顯著影響。

2.2.2 響應面分析 該數(shù)學回歸模型中響應面圖形是響應值(得率)對各因素所構(gòu)成的三維空間的曲面圖。為考察交互項對多糖得率的影響，在其他兩因素條件取最優(yōu)工藝參數(shù)值時，考察另外兩因素交互項對多糖得率的影響［19-20］。由方差分析表3可知，在本實驗所建立的數(shù)學回歸模型中，AC、BC和CD三項之間存在極顯著的交互作用。利用Design-Expert8.0.6軟件對回歸模型進行響應面分析，得到AC、BC和CD的響應面三維立體圖(圖5～圖7)。

圖5 液料比與提取次數(shù)交互作用的響應面Fig.5 The response surface and contour of interacting between liquid-solid ratio and extraction times

從圖5可以看出:響應曲面走勢劇烈，說明提取次數(shù)和液料比之間交互作用強;同時液料比的曲面較提取次數(shù)的曲面陡，亦說明當其它因素為固定時，料液比對多糖得率的影響顯著，等高線圖的圓心接近橢圓，交互作用強;沿液料比軸向的等高線密集，說明液料比對多糖得率的影響顯著性比提取次數(shù)對多糖得率的影響更加顯著。從圖7可以看出:提取次數(shù)曲面比溫度曲面平緩，當其它因素固定時，與提取次數(shù)相比提取溫度呈顯著性變化趨勢，且其等高線成橢圓，此兩因素交互作用較強，沿溫度軸的等高線較為密集，說明超聲溫度對多糖得率影響較顯著。從圖6可以看出:超聲時間曲面比提取次數(shù)曲面陡，說明超聲時間對多糖得率的影響顯著，等高線接近圓，說明這兩因素交互作用不明顯。結(jié)合表3可以得出各因素的交互作用對得率的影響由強到弱依次為 AC、CD、BC。

圖6 超聲時間與提取次數(shù)交互作用的響應面Fig.6 The response surface and contour of interacting between extraction time and extraction times

圖7 溫度與提取次數(shù)交互作用的響應面Fig.7 The response surface and contour of interacting between extraction temperature and extraction times

2.3 昆侖雪菊多糖最優(yōu)提取條件的確定和驗證實驗

通過所得回歸模型對提取工藝進行優(yōu)化，得到昆侖雪菊多糖得率的最佳工藝條件為:液料比(mL/g)為 59.6∶1，超聲時間 52.54min，提取次數(shù)為1.76次，溫度為67.90℃，在此條件下多糖得率的理論值為10.07%。為檢驗Box-Behnken(BBD)實驗設計方法的可靠性，采用上述最佳工藝條件進行驗證實驗，同時考慮到操作的方便性，將提取工藝參數(shù)修正為液料比(mL/g)60∶1，超聲時間53min，提取次數(shù)兩次，溫度68℃，設三次重復實驗。測得多糖平均得率為9.85%，相對誤差約為2.18%，實際值與理論值相差較小，說明由Box-Behnken(BBD)實驗設計方法進行該實驗條件的優(yōu)化，具有可行性。

3 結(jié)論

本論文以新疆昆侖雪菊為材料，運用了Box-Behnken(BBD)實驗設計方案，采用超聲波輔助法對昆侖雪菊多糖的提取工藝進行了研究。在單因素實驗的基礎上，利用 Design Expert軟件Box-Behnken設計法設計響應面實驗，建立了數(shù)學模型，預測了昆侖雪菊多糖最優(yōu)的提取工藝條件，并進行實驗驗證，經(jīng)修正后確定昆侖雪菊多糖最佳提取工藝條件:液料比(mL/g)60∶1，超聲時間53min，提取次數(shù)兩次，溫度68℃，此條件下昆侖雪菊多糖得率可達9.85%。超聲波輔助法對提取昆侖雪菊多糖工藝具有操作簡單、效率高等優(yōu)點，為進一步的工藝開發(fā)提供較好的參考依據(jù)。

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