馬靖峰，郭曉鳳，劉 歡，邢培川，于文功，路新枝

(中國海洋大學(xué)醫(yī)藥學(xué)院，海洋藥物教育部重點實驗室，山東省糖科學(xué)與糖工程重點實驗室，山東青島266003)

殼寡糖是由2～10個氨基葡萄糖以β-1，4糖苷鍵連接而成的低聚糖，主要由殼聚糖通過生物或物理化學(xué)方法降解獲得。殼寡糖具有水溶性好、生物利用度高、生物活性多樣等優(yōu)點［1-2］，在眾多領(lǐng)域具有重要的應(yīng)用價值。在農(nóng)業(yè)上，殼寡糖既可以作為新型農(nóng)藥防止病蟲害［3］、又可以作為生物肥提高農(nóng)副產(chǎn)品品質(zhì)［4-5］;在醫(yī)藥領(lǐng)域，殼寡糖有抗腫瘤［6］、抗炎［7］、增強免疫［8］、調(diào)節(jié)腸道微生態(tài)［9］以及對阿爾茨海默病防治等作用［10］;在食品領(lǐng)域，殼寡糖是良好的食品增稠、穩(wěn)定劑，此外還具有保鮮防腐功能［11］。隨著殼寡糖生理功能的進一步發(fā)掘，市場的需求量將日益增大，開發(fā)高效、專一的新型殼聚糖酶制劑用于制備殼寡糖已成為一種趨勢［12-14］。

海洋菌株Renibacterium sp.QD1是本實驗室從海洋環(huán)境中篩選到的一株高產(chǎn)殼聚糖酶菌株，菌株QD1僅能產(chǎn)生一種胞外殼聚糖酶Csn-A，該酶具有活性高、pH適應(yīng)范圍廣、酶解速率快等優(yōu)點。邢培川等人對QD1的發(fā)酵條件進行了初步優(yōu)化，確定了最適發(fā)酵溫度，篩選了能影響酶產(chǎn)量的因素包括碳源、氮源、無機鹽離子、pH、誘導(dǎo)劑［15］。本文在前期研究的基礎(chǔ)上利用統(tǒng)計學(xué)方法包括Plackett-Burman實驗、爬坡實驗和響應(yīng)面實驗進一步對上述各因素進行系統(tǒng)優(yōu)化，以期確定一種適合菌株Renibacterium sp.QD1大規(guī)模發(fā)酵產(chǎn)殼聚糖酶的培養(yǎng)基。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

菌株:Renibacterium sp.QD1，由本實驗室保存;3，5-二硝基水楊酸、瓊脂糖、酵母粉、蛋白胨 購自青島生工生物科技有限公司;殼聚糖粉末 購自桓臺縣金湖甲殼制品有限公司;氨基葡萄糖鹽酸鹽 購自Sigma公司;其它常規(guī)的試劑均為國產(chǎn)的分析純試劑。

高速冷凍離心機J2-MC 美國BECKMAN COULTER公司;臺式往復(fù)振蕩培養(yǎng)箱TB-12R-3F 日本高崎(TAKASAKI)科學(xué)儀器公司;酶標分析儀 深圳雷杜生命科學(xué)學(xué)院股份有限公司。

1.2 培養(yǎng)基

種子培養(yǎng)基:殼聚糖5.00g/L、酵母粉0.50g/L、KH2PO41.00g/L、K2HPO44.00g/L、MgSO40.70g/L、NaCl 1.00g/L、初始 pH6.00。

1.3 培養(yǎng)方法

1.3.1 種子培養(yǎng) 挑取固體平板上單菌落接種于50mL尖底離心管中，尖底離心管裝液量為5mL種子培養(yǎng)基，在28℃和轉(zhuǎn)速170r/min條件下培養(yǎng)24h，再按1%(v/v)接種量轉(zhuǎn)接至裝液量為50mL的500mL錐形瓶，培養(yǎng)24h的菌液作為種子液。

1.3.2 搖瓶發(fā)酵培養(yǎng) 500mL錐形瓶裝50mL發(fā)酵培養(yǎng)基，種子液以1%(v/v)的接種量接入滅菌后的發(fā)酵培養(yǎng)基中，在28℃和轉(zhuǎn)速170r/min條件下培養(yǎng)40h。

1.4 粗酶液制備

發(fā)酵上清液，在 12000r/min、4℃條件下離心10min獲得的上清液作為粗酶液。

1.5 酶活力的測定

參照文獻［15］的方法。

1.6 實驗設(shè)計

1.6.1 Plackett-Burman(PB)實驗設(shè)計 根據(jù)前期邢培川等人的實驗結(jié)果［15］，選擇了能夠影響Renibacterium sp.QD1發(fā)酵產(chǎn)殼聚糖酶的8個因素進行考察，以期篩選出能夠顯著影響殼聚糖酶產(chǎn)量的因素。實驗中以殼聚糖酶活力單位作響應(yīng)值，各實驗組設(shè)三個平行，每個因素取高、低2個水平，實驗次數(shù)n=12，實驗設(shè)計見表1。

1.6.2 最陡爬坡實驗 根據(jù)PB實驗的結(jié)果確定影響酶產(chǎn)量的顯著因素，以實驗值變化的梯度方向為爬坡方向，并根據(jù)效應(yīng)值大小確定各顯著性因素的步長，利用最陡爬坡實驗以最快速度逼近殼聚糖酶產(chǎn)量的最大響應(yīng)區(qū)［16］，并確定響應(yīng)面分析的中心點。

1.6.3 中心組合實驗設(shè)計(Central Composite Design，CCD) 根據(jù)最陡爬坡實驗結(jié)果，利用 Design-Expert.V8.0.6軟件設(shè)計 CentralCompositeDesign(CCD)實驗，三個因素及其水平見表2。進行響應(yīng)面分析，進而確定三個因素最佳水平，最后依據(jù)回歸方程建立響應(yīng)面立體分析圖。

表1 Plackett-Burman Design設(shè)計中各因素水平安排Table 1 Range of different variables in the Plackett-Burman Design

表2 CCD設(shè)計中各因素水平安排Table 2 Level and code variables screened for CCD

1.6.4 驗證實驗 選擇優(yōu)化后的發(fā)酵培養(yǎng)基進行3次獨立重復(fù)實驗，取平均值，驗證模型是否可靠，進一步確定最終優(yōu)化結(jié)果。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

實驗數(shù)據(jù)使用Design-Expert.V8.0.6軟件自動進行處理并給出統(tǒng)計結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 Plackett-Burman(PB)實驗設(shè)計及結(jié)果

通過PB實驗對殼聚糖含量(A)、起始pH(B)、淀粉含量(C)、酵母粉含量(D)、K2HPO4含量(E)、KH2PO4含量(F)、MgSO4·7H2O 含量(G)、NaCl含量(H)，8個因素進行考察，以殼聚糖酶活力為響應(yīng)值Y，實驗設(shè)計及結(jié)果見表3，結(jié)果的方差分析見表4。

表3 Plackett-Burman Design設(shè)計及結(jié)果Table 3 Plackett-Burman experiment design and results

表4 Plackett-Burman Design對酶活的方差分析Table 4 ANOVA for Plackett-Burman Design on enzyme activity

2.2 最陡爬坡實驗設(shè)計及結(jié)果

根據(jù)PB實驗結(jié)果得出對產(chǎn)酶影響顯著的3個因素是殼聚糖、酵母粉、pH，且均為正效應(yīng)，因此選擇濃度水平由低水平開始遞增，根據(jù)各因子效應(yīng)值及經(jīng)驗值確定三個因素的步長，實驗設(shè)計及結(jié)果見表5。

表5 最陡爬坡實驗設(shè)計及結(jié)果Table 5 Experimental results of the path of steepest ascent

由表5可知，在第3組實驗條件下，殼聚糖酶活力最高，故以第3組培養(yǎng)條件作為響應(yīng)面設(shè)計因素水平的中心點，即殼聚糖含量、酵母粉含量、pH分別為 11.00g/L、3.00g/L、6.50。

2.3 Central Composite Design實驗結(jié)果及分析

表6 central composite design設(shè)計及結(jié)果Table 6 Experimental design and results of central composite design

表7 CCD實驗對酶活的方差分析Table 7 ANOVA for CCD design on enzyme activity

2.4 響應(yīng)面立體圖

通過Design-Expert軟件繪制了三維響應(yīng)曲面圖，各因素對酶活的影響可由模擬的響應(yīng)面曲面圖直觀反映，其中酵母粉和pH交互作用顯著，而酵母粉與殼聚糖、殼聚糖與pH交互作用不顯著，如圖1。

圖1 兩因素對酶活的響應(yīng)面曲面圖。Fig.1 Response surface plot for the effect of two various factors on chitosanase activity production

2.5 預(yù)測優(yōu)化結(jié)果的實驗驗證

對Design Expert(version8.0)軟件預(yù)測的結(jié)果進行實驗驗證，每組設(shè)3個平行，獨立重復(fù)3次實驗，結(jié)果見表8，實測值608.11U/mL與預(yù)測值626.46U/mL比較接近，較好的重現(xiàn)了預(yù)測結(jié)果，說明優(yōu)化的結(jié)果是可靠的。

表8 優(yōu)化結(jié)果的驗證Table 8 Experimental verification of the theoretical optimum

3 結(jié)論

本文通過Plackett-Burman實驗從8個因素中快速篩選出對Renibacterium sp.QD1發(fā)酵產(chǎn)殼聚糖酶顯著影響的3個因素分別是殼聚糖、酵母粉、起始pH，以最陡爬坡實驗逼近最大響應(yīng)值區(qū)域，然后利用CCD實驗對篩選出的3個顯著性因子進一步優(yōu)化，擬合了殼聚糖、酵母粉、起始pH，3個因素對殼聚糖酶酶活力的回歸模型，由該模型預(yù)測的最優(yōu)工藝條件為殼聚糖14.23g/L、酵母粉4.72g/L、起始pH6.42，以預(yù)測的最優(yōu)培養(yǎng)基進行3次獨立的重復(fù)實驗，殼聚糖酶酶活力達到608.11U/mL，與預(yù)測值626.46U/mL比較接近，說明通過響應(yīng)面優(yōu)化Renibacterium sp.QD1發(fā)酵產(chǎn)殼聚糖酶是合理可靠的。至此，我們開發(fā)出一種適合大規(guī)模發(fā)酵的新型培養(yǎng)基:殼聚糖14.23g/L、淀粉3.00g/L、酵母粉 4.72g/L、KH2PO41.00g/L、K2HPO44.00g/L、MgSO40.70g/L，初始 pH6.42，優(yōu)化結(jié)果與前期的實驗結(jié)果400.00U/mL比較，經(jīng)優(yōu)化酶活力單位提高了52.03%。

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