劉紅芳，鄧澤元，徐 靚，陳華蓉，劉文群，*

(1．南昌大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國家重點實驗室，江西南昌330047;2．江西省環(huán)境信息中心，江西南昌330077)

硒(Se)是一種對生物系統(tǒng)具有廣泛影響的重要微量元素，包括抗氧化、抗癌、抗病毒和促生長繁殖等生物學(xué)效應(yīng)［1-4］。但硒在生物活性和毒性之間范圍極端狹窄，容易接近或進(jìn)入了硒的毒性范圍。因此，開發(fā)低毒、高效的硒源一直是硒營養(yǎng)研究的重點［5］。零價單質(zhì)硒可通過化學(xué)或生物學(xué)方法合成納米尺寸的單質(zhì)硒［6］。大量研究表明，相比二價或者四價硒離子，納米尺寸的單質(zhì)硒毒性低［3，7-8］。小鼠急性毒性和慢性毒性實驗表明，納米硒毒性遠(yuǎn)低于亞硒酸鈉(納米硒 LD50=112．98mg/kg·BW，亞硒酸鈉 LD50=15．72mg/kg·BW)［9-11］。因此納米硒成為替代其他形式硒營養(yǎng)制劑或藥劑的最佳選擇［12］。一些對無機(jī)硒耐受性強(qiáng)的微生物，能夠?qū)⒘鶅r和四價硒轉(zhuǎn)化為紅色零價硒。國外在利用微生物進(jìn)行硒的還原方面研究的較多，已經(jīng)從最初的菌株的篩選發(fā)展到現(xiàn)在對還原機(jī)理的探究［13-14］，而我國在這方面研究較少，目前報道的只有利用固氮紅細(xì)菌(Rhodoacter azotoformans)［15］假 單 胞 菌 (Pseudomonas alcaliphila MBR)［16-17］、芽孢桿菌 HBS4(Bacillus HBS4)［18］、棒狀菌屬(Corynebacterium spp)［19］來形成納米尺寸的紅色單質(zhì)元素硒;但是國外研究學(xué)者還發(fā)現(xiàn)嗜麥芽寡養(yǎng)單胞 菌 (stenotrophomonas maltophilia)［20］、大 腸 桿 菌(Escherichia coli)［21］、根 瘤 菌 (Rhizobium sp．Strain B1)［22］、Tetrathiobacter kashmirensis［23］等微生物能將亞硒酸鹽或者硒酸鹽還原成紅色納米單質(zhì)硒。生物體形成的納米單質(zhì)硒，對熱穩(wěn)定，不轉(zhuǎn)化形成灰或黑色元素硒。

本實驗采用的乳酸菌是可食用的益生菌，無需考慮其安全性問題。隨著人口的不斷老齡化和人們對保健食品的需求急劇增加，納米硒高效高安全的優(yōu)勢使其在國內(nèi)和國際保健品市場上具有強(qiáng)大的競爭力，納米硒作為保健食品和藥物開發(fā)前景廣闊。本實驗利用對亞硒酸鈉有較強(qiáng)耐受性的一株編號LA4乳酸菌株進(jìn)行亞硒酸鈉還原反應(yīng)，制備納米硒。通過動物(昆明系小鼠)實驗，研究分析乳酸菌LA4源納米硒對抗氧化性能的影響。

1 材料和方法

1.1 材料與儀器

1．1．1 菌種 已篩選得到的乳酸菌 LA4［24］。

1．1．2 培養(yǎng)基 MRS 液體培養(yǎng)基［25］

1．1．3 實驗動物 昆明系小鼠，體重18～22g，購自南昌大學(xué)動物科學(xué)組。

1．1．4 主要試劑 谷胱甘肽過氧化物酶試劑盒、總超氧化物歧化酶(T-SOD)試劑盒、丙二醛(MDA)試劑盒、過氧化物酶(POD)試劑盒、過氧化氫酶(CAT)試劑盒以及總抗氧化能力(T-AOC)試劑盒(均購自南京建成生物工程研究所)。

1．1．5 主要設(shè)備 場掃描電鏡(SEM)+能量分析光譜儀(EDX)(FEI)，DNM-9602酶標(biāo)分析儀 北京普朗新技術(shù)有限公司;752N紫外-可見分光光度計 上海精科;飛鴿KA-1000型離心機(jī);電熱恒溫水浴鍋 上海醫(yī)療器械三廠;電熱恒溫培養(yǎng)箱 上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠;快速混勻器SK-1 國華。

1.2 實驗方法

1．2．1 乳酸菌LA4源納米硒的制備 納米硒制備方法［26］:在裝有100mL MRS液體培養(yǎng)基的三角瓶中加入滅菌的亞硒酸鈉，使終濃度為4mmol/L(69．28mg/L)。再接入已活化的乳酸菌，在37℃、150r/min振蕩培養(yǎng)48h;收集發(fā)酵液，4000×g，離心10min，棄上清;沉淀物用0．9%NaCl溶液洗滌并且離心后，轉(zhuǎn)入研缽;

加入液氮使細(xì)胞冷凍，用研棒研磨;

研磨后形成的粘合液于100W破碎5min，破碎完成后用含1%SDS(超純水溶解)的1．5mol/L Tris/HCl buffer(pH8．3)連續(xù)離心洗滌3次;

沉淀物重懸于超純水中，最終重懸液中包含SeNPs(納米硒顆粒)和細(xì)胞碎片;

將4mL的重懸液轉(zhuǎn)入試管中，并加入2mL仲辛醇于每個試管中，劇烈搖晃，溶液分成兩層;

混合的兩相通過2000×g，離心5min而分開，離心后放入4℃冰箱保存24h;

產(chǎn)生的SeNPs沉淀于試管底部，細(xì)胞碎片仍懸浮于兩相之間;

將上層的棄之，沉降的納米硒顆粒依次通過氯仿、乙醇、和無菌水洗滌，如果進(jìn)一步表征和生物實驗，洗干凈的SeNPs重懸于超純水中，并保存于4℃冰箱中。

1．2．2 乳酸菌 LA4源納米硒的表征 場掃描電鏡(SEM)+能量分析光譜儀(EDX):洗干凈的SeNPs重懸于超純水中，用毛細(xì)管吸取菌懸液滴在銅片上，室溫干燥后進(jìn)行SEM-EDX測試觀察。

1．2．3 動物分組 雄性昆明系小鼠適應(yīng)飼養(yǎng)一周后按體重隨機(jī)分為4 組［4，27-29］:對照組，0．2mg/kg 納米硒組(低劑量組)，0．5mg/kg納米硒組(中劑量組)，1．0mg/kg納米硒組(高劑量組)，每組10只雄性昆明系小鼠。對照組:每只小鼠灌胃0．5mL的超純水;3組納米硒組:每只小鼠灌胃0．5mL納米硒溶液，但3組納米硒組灌胃濃度分別控制在0．2mg/kg·bw(小鼠體重)、0．5mg/kg·bw 和1．0mg/kg·bw;灌胃期為 15d［10］。

1．2．4 乳酸菌LA4源納米硒對小鼠抗氧化性能的影響 谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-PX)、總超氧化物歧化酶(T-SOD)、丙二醛(MDA)、過氧化物酶(POD)、過氧化氫酶(CAT)活性以及總抗氧化能力(T-AOC)的測定:嚴(yán)格按照購買的試劑盒說明書測定小鼠血清、全血、以及組織勻漿液的各種酶活性。

1．2．5 統(tǒng)計學(xué)分析 各處理間平均值的比較采用方差分析中的最小顯著極差法(LSD)，結(jié)果以Mean±SD表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 乳酸菌LA4源納米硒的表征

發(fā)酵液經(jīng)4000×g離心10min收集菌體，所得菌體再用無菌生理鹽水洗滌三次，用毛細(xì)管吸取菌懸液滴在銅片上，室溫干燥后進(jìn)行SEM-EDX測試，得到圖1的結(jié)果，從掃描電鏡圖上可以看出發(fā)酵液中有大量球狀顆粒出現(xiàn)，同時對其球狀顆粒進(jìn)行能量分析光譜儀測試可以看出，這些球狀顆粒大部分是硒元素，由此判斷乳酸菌LA4能將亞硒酸鈉還原成納米尺寸(小于200nm)的球狀硒顆粒。圖2是按照文獻(xiàn)［26］提取的方法進(jìn)行納米硒提取的掃描電鏡圖，從圖中可以看到大量球狀納米硒，但有的球狀顆粒被營養(yǎng)液包裹住了。

2.2 灌胃期小鼠體重的變化

圖1 乳酸菌LA4還原亞硒酸鈉形成納米硒SEM-EDX測試圖Fig．1 SEM-EDX spectra of reduction of Selenite to Se(0)nanoparticles by LA4 lactobacillus

圖2 已提取納米硒顆粒場發(fā)射掃描電鏡圖Fig．2 FESEM photographs of being extracted Se(0)nanoparticles

由圖3可知，低、中和高劑量組小鼠體重增量都大于對照組小鼠，低和中劑量組體重增量最明顯，其次是高劑量組。從而表明納米硒對小鼠體重增長有一定的促進(jìn)作用。

圖3 灌胃期內(nèi)不同濃度的乳酸菌LA4源納米硒對小鼠體重的影響Fig．3 The effect on body weight of mice with different Se(0)nanoparticles by LA4 lactobacillus concentrations during lavaging

2.3 整組小鼠日體重增量與日采食量的關(guān)系

由表1可以看出，納米硒添加濃度在0～0．5mg/kg，小鼠生長性能隨著硒添加濃度的增加而提高;與不添加納米硒的空白對照組相比，低中高劑量組日增重分別提高了 20．49%(p ＜ 0．01)、24．88%(p ＜ 0．01)以及12．68%(p ＜ 0．05)，料重比降低了 9．64%(p ＜0．05)、18．94%(p ＜0．01)以及 8．70%(p ＞ 0．05);與高劑量組相比，中劑量組小鼠日增重提高了10．82%(p＜0．05);其他實驗組之間無顯著性差異。

表1 不同濃度納米硒組小鼠日體重增量、日采食量和料重比Table 1 Average daily gain、Average Daily Feed Intake and material weight ratio

2.4 小鼠全血、血清、組織的GSH-PX活力測定

從表2可知，納米硒對小鼠GSH-PX酶有一定影響，而且納米硒添加濃度在 0～0．5mg/kg·bw 時，GSH-PX酶活力隨著納米硒濃度的增加而增加;與不添加納米硒的空白對照組相比，低、中和高劑量組小鼠全血和睪丸組織中GSH-PX活力都得到了極顯著提高(p＜0．01)。低、中和高劑量組小鼠血清中GSH-PX 活力分別提高了 2．12%(p ＞ 0．05)、5．27%(p ＜0．05)以及 4．50%(p ＜0．05)，肝組織 GSH-PX 活力分別提高了 10．27%(p ＜ 0．05)、7．83%(p ＞ 0．05)、7．45%(p＞0．05)，腎臟組織 GSH-PX 活力分別提高了 9．78%(p ＜0．05)、28．39%(p ＜ 0．01)、22．45%(p ＜0．01)。因此可以表明納米硒對小鼠全血、血清以及各重要器官的谷胱甘肽過氧化物酶的活力具有一定程度的提高作用，尤其對小鼠全血、睪丸中的谷胱甘肽過氧化物酶的活力具有極顯著提高作用。Rotruck首次發(fā)現(xiàn)GSH-Px是一種含硒酶，揭開了硒具有抗氧化功能之謎［30］。本實驗中對小鼠灌胃納米硒，納米硒在小鼠體內(nèi)通過一系列途徑轉(zhuǎn)化成硒蛋白(包含GSH-Px)［31］，因此小鼠體內(nèi) GSH-Px活力升高。由于納米硒通過提高小鼠體內(nèi)GSH-Px活力，從而提高小鼠抗氧化作用，接下來通過檢測小鼠體內(nèi)SOD、MDA等指標(biāo)綜合研究納米硒是否提高了小鼠抗氧化活性。

2.5 小鼠血清、組織的T-SOD活力測定

從表3可以看出納米硒可以極顯著的提高小鼠肺組織、肝臟和心臟中T-SOD活力(p＜0．01)，而且納米硒添加濃度在0～0．5mg/kg·bw時，小鼠肺組織、肝臟和心臟中T-SOD活力隨納米硒濃度的增加而提高。與對照組相比，中劑量組小鼠肺組織T-SOD活力提高的最明顯，比對照組提高了2．38倍(138．04%);低劑量組小鼠大腦和腎臟組織中T-SOD活力顯著提高(p＜0．05)，但對小鼠脾臟組織和血清中的T-SOD活力提高作用并不顯著(p＞0．05)。中和高劑量組小鼠脾臟、腎臟組織和血清中T-SOD活力也得到了極顯著提高(p＜0．01)，大腦中T-SOD活力分別提高了27．89%(p ＜ 0．01)、11．15%(p ＜ 0．05)。由此表明納米硒對小鼠血清以及重要器官組織中的T-SOD活力都具有一定的提高作用，并且納米硒添加水平增加到1．0mg/kg時，納米硒對小鼠血清、器官組織中的T-SOD活力仍然具有提高作用。

表2 GSH-PX含量的測定Table 2 GSH-PX activity assay results

表3 小鼠器官、血清T-SOD活力Table 3 T-SOD activity of organs and serum in mice

表4 組織中T-AOC的測定結(jié)果(U/mgprot)Table 4 Tissue T-AOC activity assay results(U/mgprot)

2.6 乳酸菌LA4源納米硒對小鼠全血、血清、組織的T-AOC活力的影響

2．6．1 小鼠全血、血清T-AOC活力的測定 從圖4可以看出，納米硒對小鼠血清中T-AOC含量沒有顯著性提高作用(p＞0．05)。而對小鼠全血中T-AOC含量具有極顯著提高作用(p＜0．01)，納米硒添加濃度在0～0．5mg/kg·bw 時，小鼠全血中 T-AOC 活力隨納米硒濃度的增加而提高;并且納米硒添加水平就算增加到1．0mg/kg·bw時，納米硒仍然具有提高小鼠全血T-AOC含量的作用。

2．6．2 小鼠重要器官組織中T-AOC活力的測定 從表4可以得到，各實驗組小鼠大腦、肝臟、脾臟和腎臟組織T-AOC活力均得到了極顯著提高作用(p＜0．01)，對脾臟和腎臟組織中的提高作用最明顯，各實驗組脾臟組織T-AOC活力分別提高了2．95、3．23和2．93倍，腎臟組織 T-AOC 活力分別提高了4．08、4．69、4．69 倍;中和高劑量組小鼠肺組織中T-AOC 活力也得到了極顯著提高作用(p＜0．01)，但低劑量組小鼠肺組織中T-AOC活力只是顯著提高(p ＜0．05)。

圖4 乳酸菌LA4源納米硒對小鼠血清、全血T-AOC含量的影響Fig．4 The effect of LA4 lactic acid bacterially synthesized Se(0)nanoparticles on serum and the whole blood T-AOC content in mice

2.7 不同濃度納米硒組小鼠各組織POD活力比較

由表5可以得到，納米硒極顯著提高小鼠脾臟、大腦、肝臟和肺的過氧化物酶活力(p＜0．01)，并且納米硒添加水平在0～0．5mg/kg·bw時，隨著納米硒濃度的增加，各器官的過氧化物酶活力逐漸提高。低劑量組小鼠心臟中的過氧化物酶活力沒有明顯提高(p ＞0．05)，但納米硒添加濃度增加到 0．5mg/kg·bw時，小鼠心臟中的過氧化物酶活力得到極顯著提高。低、中和高劑量組小鼠脾臟中POD活力分別提高了13．70%(p ＜ 0．01)、44．70%(p ＜ 0．01)、33．85%(p ＜0．01)，心臟中 POD 活力分別提高了 7．98%(p ＞0．05)、13．97%(p ＜ 0．01)、11．98%(p ＜ 0．05)，大腦中POD 活力分別提高了 28．00%(p ＜ 0．01)、66．00%(p ＜0．01)、56．00%(p ＜0．01)，肝臟中 POD 活力分別提高 了 23．84%(p ＜ 0．01)、43．61%(p ＜ 0．01)、36．05%(p ＜ 0．01)，肺 中 POD 活 力 分 別 提 高 了36．82%(p ＜ 0．01)、43．18%(p ＜ 0．01)、40．00%(p ＜0．01)。

表5 組織POD活力測定結(jié)果(U/mgprot)Table 5 tissue POD activity assay results(U/mgprot)

表7 各器官組織MDA含量(nmol/ml)Table 7 tissue MDA content assay results

2.8 各組小鼠血清、重要器官丙二醛含量的比較

2．8．1 小鼠血清中丙二醛含量的測定［32］由表6可知，與對照組相比，低劑量組小鼠血清MDA含量并沒有明顯降低(p＞0．05);但當(dāng)納米硒添加濃度增加到0．5mg/kg·bw時，小鼠血清MDA含量得到了極顯著降低(p＜0．01);就算納米硒添加濃度增加到1．0mg/kg·bw，小鼠血清 MDA 含量也有所下降(p＜0．05)。

表6 血清MDA含量測定結(jié)果(nmol/mL)Table 6 Serum MDA content assay results(nmol/mL)

2．8．2 小鼠重要器官組織中丙二醛含量的測定 由表7數(shù)據(jù)分析可知，納米硒有利于降低組織器官中MDA的含量(p＜0．05)，低、中和高劑量組小鼠肺中丙二醛含量分別降低了 25．06%(p ＜ 0．01)、30．23%(p ＜0．01)、25．54%(p ＜0．01)，肝臟中丙二醛含量分別降 低 了 2．57%(p ＞ 0．05)、21．05%(p ＜ 0．05)、7．36%(p ＞ 0．05)，脾臟中丙二醛含量分別降低了20．15%(p ＜ 0．01)、24．42%(p ＜ 0．01)、21．19%(p ＜0．01)，大腦中丙二醛含量分別降低了 6．50%(p ＞0．05)、14．66%(p ＜ 0．01)、7．43%(p ＞ 0．05)，腎臟中丙二醛含量分別降低了 9．86%(p ＜ 0．05)、13．89%(p ＜0．01)、11．37%(p ＜0．05)，心臟中丙二醛含量分別降低了 17．12%(p ＜ 0．01)、20．03%(p ＜ 0．01)、17．34%(p ＜0．01)。

3 結(jié)論與討論

動物機(jī)體在正常代謝過程中，體內(nèi)大量的不飽和脂肪酸極易受過氧化作用而產(chǎn)生脂質(zhì)過氧化物，體內(nèi)自由基就是由脂質(zhì)過氧化作用而不斷產(chǎn)生的，過多的自由基會損害機(jī)體細(xì)胞的結(jié)構(gòu)功能，進(jìn)而損傷生物體的各種生理功能。酶類抗氧化劑是生物體防御脂質(zhì)過氧化作用損傷的重要組成部分，它包括GSH-Px、SOD等。Rotruck首次發(fā)現(xiàn)硒是谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)的成分，揭開了硒具有抗氧化功能之謎［30］。硒是機(jī)體內(nèi)的主要抗氧化酶GHS-Px的必需組分，通過過氧化物酶阻止自由基產(chǎn)生的脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，從而起到抗氧化的作用。而且硒的生物學(xué)效應(yīng)與其濃度密切相關(guān)。大量研究發(fā)現(xiàn)納米單質(zhì)硒比無機(jī)硒和有機(jī)硒更容易吸收，這主要是因為納米粒子有大量奇異性質(zhì)，與更宏觀的粉末、塊體和更微觀的原子、納米粒子具有獨(dú)特的小尺寸效應(yīng)、量子尺寸效應(yīng)、表面效應(yīng)和宏觀量子隧道效應(yīng)［33］。

本實驗測試GSH-Px、SOD、MDA等5個抗氧化指標(biāo)，GSH-Px是一種含硒酶，具有抗氧化功能，可防止有害自由基的形成及其對不飽和脂肪酸的進(jìn)攻，催化過氧化物還原為己醇，從而清除組織中有害的氫過氧化物，保護(hù)生物大分子和生物膜結(jié)構(gòu)免受過氧化物損傷，其作用在于轉(zhuǎn)化過氧化物為相關(guān)的醇類(或水)并能清除自由基［34］。本實驗中對小鼠灌胃納米硒，納米硒在小鼠體內(nèi)通過一系列途徑轉(zhuǎn)化成硒蛋白(包括GSH-Px)［31］。實驗結(jié)果表明納米硒對小鼠全血、血清以及各重要器官的GSH-Px活力、TOC、T-SOD和組織POD活力都具有一定程度的提高作用，從而表明乳酸菌LA4源納米硒對小鼠抗氧化性能具有提高作用，納米硒添加水平在0～0．5mg/kg·bw時，隨著納米硒濃度的增加，小鼠抗氧化性能也基本隨之提高，并且乳酸菌LA4源納米硒添加水平增加到1．0mg/kg·bw時，仍然對小鼠抗氧化性能具有提高作用。小鼠抗氧化性能的提高與納米硒提高GSH-Px活力息息相關(guān)。與王福香等［35］研究納米硒對肉雞肝臟硒含量和抗氧化能力的影響相比，乳酸菌源納米硒對提高 T-SOD，T-AOC和GSH-Px活力更明顯。

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