李素芬，郭尚敬

(1．聊城大學生命科學學院，山東聊城252000;2．聊城大學藥學院，山東聊城252000)

目前腫瘤已成為致人死亡的第二大殺手，探究高效低毒的抗腫瘤藥物，已是世界范圍內(nèi)的研究熱點。中藥也加入此行列，多組分中藥已盛行。復方阿膠漿是山東省東阿阿膠股份有限公司獨家生產(chǎn)的中藥保健品，由熟地黃、人參、阿膠、黨參等中藥制成［1］。復方阿膠漿不僅可用于補血，在臨床應用中還可以作為抗癌、抗腫瘤的輔助治療手段。

近幾年，研究者對復方阿膠漿的研究主要集中在臨床作用效果或者建立動物模型方面，例如，曾屈波［2］等發(fā)現(xiàn)復方阿膠漿臨床治療因放化療而致的白細胞減少的病例中，可明顯延長生存期，改善病人生活質量。何佩珊［3］等發(fā)現(xiàn)復方阿膠漿具有治療或延緩腫瘤化療相關性貧血的作用，能顯著改善腫瘤化療相關性貧血患者的臨床癥狀和生活質量。趙井苓［4］等在研究中證明了復方阿膠漿可減輕化療的骨髓抑制作用。劉培民［5］等發(fā)現(xiàn)復方阿膠漿對荷Lewis肺癌小鼠具有一定的抑瘤作用，較化療藥組有明顯的優(yōu)勢。聯(lián)合放療可見到瘤重明顯縮小，出現(xiàn)協(xié)同增效作用。劉培民［6］等還發(fā)現(xiàn)復方阿膠漿對S180肉瘤具有一定的抑瘤作用，可明顯延長荷瘤小鼠的生存時間，聯(lián)合化療應用就有協(xié)同增效作用，并可減少化療所帶來的白細胞減少及免疫力低下等副作用。

由于目前很多報導都是以臨床患者或者建動物模型，來研究復方阿膠漿對癌癥患者具有良好的預后效果，而對阿膠或復方阿膠漿在體外細胞株培養(yǎng)方面的報導少之又少。還沒發(fā)現(xiàn)對復方阿膠漿納米級組分(英文簡稱CEJSNC)的相關報導，尤其是對CEJSNC在體外培養(yǎng)細胞株方面的報導。為了更直觀展示復方阿膠漿的抗癌作用，本研究更關注復方阿膠漿納的微組分，創(chuàng)新性的獲得CEJSNC，它們富含多種生物活性組分，主要包含寡肽，氨基酸，微量元素，該組分具有易吸收的特點，進一步從體外細胞培養(yǎng)層面，在DOX模擬化療前、后，研究CEJSNC對骨髓細胞和癌細胞增殖抑制的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

復方阿膠漿 山東東阿阿膠股份有限公司;星昊美彤復方消化酶膠囊 北京星昊醫(yī)藥股份有限公司;注射用鹽酸阿霉素(DOX) 浙江海正藥業(yè)股份有限公司;protein Ladder Thermo公司。

1.2 實驗方法

1．2．1 CEJSNC的制備 取一支20mL的復方阿膠漿轉移到50mL的離心管中，用NaOH，調pH由原來的5．12 至木瓜酶的最適 pH5．65≈5．7，加入一粒提前粉碎的木瓜酶，37℃孵育2h。用HCl調pH，由原來的5．65 至胃蛋白酶的最適 pH1．92≈2．0，加入一粒提前粉碎的胃蛋白酶，37℃孵育5h。用NaOH調pH，由原來的1．92 至胰蛋白酶的最適 pH7．92≈8．0，加入一粒提前粉碎的胰蛋白酶，37℃孵育5h。調pH與培養(yǎng)基一致為pH7．4。高速冷凍離心機在4℃下8000r/min離心10min，取上清;先用濾紙過濾，再用10K的超濾離心管3000r/min進行超濾;在超凈工作臺中，用PALL 0．2μm一次性針頭濾器過濾分裝。

1．2．2 復方阿膠漿消化處理前、后的樣品紫外光譜測定 用250～800nm紫外吸收光譜進行復方阿膠漿消化處理前、后的樣品的吸收波長的掃描，確定了主要成分為寡肽、氨基酸。

1．2．3 SDS-PAGE 電泳 根據(jù) Laemmli［7］的方法，分別制備5%聚丙烯酰胺濃縮膠和12%聚丙烯酰胺分離膠，用SDS-PAGE電泳鑒定其消化前后的組分降解效果。

1．2．4 ALV-DLS 表征CEJSNC分子的大小。

1．2．5 骨髓造血干細胞的獲取 取一只健康的小鼠，通過脫臼處死，浸泡在75%乙醇中，2min后置于超凈臺中，取出小鼠，腹面朝上用針頭固定四肢，用手術剪，剪開后肢一側的皮膚，去掉股骨上的肉，置于PBS中，再取另外一根股骨;準備培養(yǎng)基，用5mL的注射器(0．33mm的針頭)，用手術剪在股骨關節(jié)處略微剪一下，不能把其完全剪掉，用吸有5mL的培養(yǎng)基的注射器對其骨髓內(nèi)部沖洗，并收集于15mL離心管中，離心，再加適量培養(yǎng)基重懸(取部分進行培養(yǎng))、計數(shù)、鋪板。

1．2．5．1 CEJSNC和DOX對骨髓細胞處理 通過計數(shù)并稀釋至1×106/mL，接種于96孔板，5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)孵育過夜后，按梯度加CEJSNC(終濃度按體積百分比):1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%。按梯度加 DOX(μg/mL):1、2、3、4、5、6、7、8、9、10，各三個重復。孵育24h 后，每孔加10uL 的CCK-8并孵育2h，用酶標儀進行檢測細胞增殖抑制情況。并確定最佳阿霉素濃度為4μg/mL。

他怎么可以說我是個沒媽的孩子？我又怎么可能沒有媽呢？如果沒有媽，我是古意從哪里弄來的？而且從六歲的時候，我就已經(jīng)知道了康美娜的存在。

1．2．5．2 CEJSNC 和 DOX 聯(lián)合時對骨髓細胞的影響取對數(shù)期培養(yǎng)的骨髓細胞鋪96孔板，密度1×106/mL，5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)孵育過夜后，按梯度加復合組分，設立空白對照，4μg/mL DOX對照，實驗組為4μg/mL DOX+2%微組分、4μg/mL DOX+4%微組分、4μg/mL DOX+8%微組分，各三個重復。孵育24h后，每孔加10μL的CCK-8并孵育2h，用酶標儀進行檢測細胞增殖抑制情況。

1．2．6 細胞培養(yǎng) 參照劉文哲［8］等人介紹的方法復蘇乳腺癌細胞(N87)、胃癌細胞(MCF-7)和白血病細胞(Raji)分別接種于 50mL培養(yǎng)瓶，加入RPMI1640培養(yǎng)液(含10%小牛血清和青、鏈霉素各100U/mL)8mL，置于37℃、飽和濕度、含5%CO2的CO2細胞培養(yǎng)箱中無菌培養(yǎng)。每2～3d更換一次培養(yǎng)液。細胞長至2～5d左右，用倒置相差顯微鏡觀察細胞長滿貼壁細胞，即可傳代。在無菌操作臺中，用吸管吸去舊培養(yǎng)液，換用新的無菌吸管吸取0．25%胰蛋白酶液2mL以剛沒過細胞層為度，進行消化，靜置約2～5min，并不時在倒置相差顯微鏡下觀察，當細胞界限模糊不清時取新吸管小心吸棄胰蛋白酶液，加入2～3mL PBS液，輕輕轉動培養(yǎng)瓶，小心吸取PBS液，加入完全培養(yǎng)液，用吸管取培養(yǎng)液輕輕吹打瓶壁細胞，使其脫離瓶壁形成單細胞懸液，用細胞計數(shù)板在顯微鏡下計數(shù)，取實驗所需細胞數(shù)分瓶，并置于含5%CO2的CO2細胞培養(yǎng)箱中無菌培養(yǎng)。每5～7d傳代一次，實驗時取對數(shù)生長期細胞。

1．2．6．1 用CEJSNC 和DOX 對體外培養(yǎng)的乳腺癌、胃癌和白血病細胞處理 取對數(shù)生長期的N87、MCF-7、Raji 三種癌細胞，加入0．25%胰蛋白酶液消化，用PBS液洗滌2次，離心后吸棄上清液，用4mL培養(yǎng)液重懸細胞，計數(shù)，稀釋分別以1×104/孔、1×104/孔和1×105/孔接種于96孔板。待細胞豐度達到70%～80%時，按梯度加CEJSNC(終濃度按體積百分比):1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%，并設立空白對照;按梯度加DOX(μg/mL):1、2、3、4、5、6、7、8、9、10 各三個重復。待 24h 后，去舊培養(yǎng)基，加10%的CCK-8培養(yǎng)基孵育2h，用酶標儀進行檢測。以確定作用三種細胞的最佳濃度分別是多少。

1．2．6．2 CEJSNC 和 DOX 聯(lián)合時對體外培養(yǎng)的乳腺癌、胃癌和白血病細胞的影響 取對數(shù)生長期的N87、MCF-7、Raji三種癌細胞，加入 0．25% 胰蛋白酶液消化，用PBS液洗滌2次，離心后吸棄上清液，用4mL培養(yǎng)液重懸細胞，計數(shù)，稀釋分別以1×104/孔、1×104/孔和1×105/孔接種于96孔板。待細胞豐度達到70%～80%時，MCF-7、Raji細胞的處理如下:設立空白對照，6μg/mLDOX對照，實驗組為6μg/mL DOX+2%CEJSNC、6μg/mLDOX+4%CEJSNC、6μg/mL DOX+8%CEJSNC，各三個重復;N87細胞的處理如下:設立空白對照，8μg/mL DOX對照，實驗組為 8μg/mL DOX+2%CEJSNC、8μg/mL DOX+4%CEJSNC、8μg/mL DOX+8%CEJSNC，各三個重復。孵育24h后，每孔加10μL的CCK-8并孵育2h，用酶標儀進行檢測細胞增殖抑制情況。

1．2．7 數(shù)據(jù)處理 用 SPSS統(tǒng)計軟件、Excel等統(tǒng)計軟件對實驗數(shù)據(jù)進行數(shù)據(jù)顯著性處理，利用制圖origin軟件進行數(shù)據(jù)的處理和分析。

2 結果與分析

2.1 通過紫外掃描分光光度級對復方阿膠漿消化處理前后的樣品進行吸收波長的掃描，以確定復方阿膠漿原漿(CEJS)和復方阿膠漿納米組分(CEJSNC)的主要組分

寡肽、氨基酸在260～280nm處有最大吸收波長。復方阿膠漿消化處理前后的樣品在270nm左右處都有最強吸收峰，見(圖1、圖2)，進一步確認復方阿膠漿原漿和經(jīng)消化降解后的主要成分為寡肽、氨基酸。

圖1 CEJS的紫外-可見掃描結果Fig．1 Ultraviolet absorotion soectroscodV of CEJSNC

2.2 通過蛋白質電泳技術來觀察其消化前后的組分降解效果

圖2 CEJSNC的紫外-可見掃描結果Fig．2 Ultraviolet absorotion soectroscodV of CEJSNC

如(圖2)實驗結果表明復方阿膠漿中大分子蛋白質通過模擬消化系統(tǒng)已充分分解為小分子多肽或氨基酸。再通過12%的聚丙烯酰胺凝膠檢測樣品處理前后組分的變化情況，表明通過處理后獲得了大量的小于10ku的組分;Thermo公司protein Ladder大小(ku)依次為:170、130、100、70、55、40、35、25、15、10。

圖3表明復方阿膠漿原液(CEJS)由不同分子量大小的蛋白、寡肽、氨基酸組成，在150ku最集中，10ku以下很少;由圖4可見條帶主要集中于10ku，說明復方阿膠漿中大分子蛋白質通過模擬消化系統(tǒng)已充分分解為小分子多肽或氨基酸。

圖3 CEJS 12%SDS-PAGE電泳圖Fig．3 12%SDS-PAGE of compound glue mucilage protoplasm

圖4 CEJSNC 12%SDS-PAGE電泳圖Fig．4 SDS-PAGE of compound glue mucilage micro components

2.3 通過ALV-DLS表征CEJSNC 的顆粒度大小

利用ALV-DLS光散射儀檢測復方阿膠漿消化處理前后其組分分子顆粒度的變化，結果表明，CEJS經(jīng)消化處理后，得到了直徑為4nm的微小組分，而處理前直徑約1μm，所以CEJSNC更易被細胞直接吸收，見(圖 5)。

圖5 CEJS、CEJSNC的顆粒度檢測圖譜Fig．5 Particle size detection map of CEJS and CEJSNC

2.4 通過用CEJSNC對小鼠骨髓細胞的體外細胞實驗，探究了CEJSNC對造血功能產(chǎn)生的影響

圖6顯示在DOX濃度為4μg/mL時對骨髓細胞的抑制作用最強;圖7表明隨著CEJSNC使用濃度的增加，其對骨髓細胞增殖的促進作用也越顯著;在與阿霉素聯(lián)合使用時，與單獨使用DOX的對照組對比，CEJSNC都能顯著促進對體外培養(yǎng)的小鼠骨髓細胞的增殖(p＜0．01)，甚至在高濃度下比空白組的骨髓細胞都生長良好(見圖8)。所以 CEJSNC具有保護骨髓造血系統(tǒng)的功能，對貧血、失血、血氣不足的人具有良好的療效。

圖6 不同濃度DOX對骨髓細胞增殖抑制的影響Fig．6 Different concentration of DOX make an effect on the proliferation inhibition of bone marrow cells

2.5 通過乳腺癌、胃癌和白血病細胞的細胞實驗，探究了CEJSNC的抗腫瘤作用

結果表明:CEJSNC對癌細胞有一定抑制作用，尤其是乳腺癌細胞MCF-7效果顯著性(p＜0．01)，如圖10所示;在高濃度下對胃癌細胞抑制有顯著性(p＜0．01)，如圖9所示;而高濃度的 CEJSNC對Raji細胞有輕微增殖促進作用，但不顯著(p＞0．05)，如圖11所示。

2.6 通過化療藥物鹽酸阿霉素對細胞的增殖抑制實驗，尋找鹽酸阿霉素對三種癌細胞的最佳作用濃度。圖12顯示:DOX在濃度為8μg/mL時，胃癌N87細胞存活率最低，而對乳腺癌MCF-7細胞和白血病Raji細胞在濃度為5～7μg/mL時，其存活率最低。以此為最佳濃度。

圖7 不同濃度CEJSNC對骨髓細胞的影響Fig．7 Different concentration of CEJSNC make an effect on the proliferation inhibition of bone marrow cells．

圖8 三種不同CEJSNC與DOX聯(lián)合對骨髓細胞的影響Fig．8 Three different concentration of CEJSNC combined with DOX have effects on bone marrow cell

圖9 不同濃度的CEJSNC對N87細胞增殖抑制的影響Fig．9 Different concentration of CEJSNC make an effect on the proliferation inhibition of N87 cells

2.7 利用DOX模擬化療環(huán)境，研究CEJSNC對癌細胞的增殖抑制作用

結果:結合圖13、圖14，在與單獨使用阿霉素對照組相比(右半部分)，發(fā)現(xiàn)中低濃度的CEJSNC對癌細胞的增殖沒有抑制作用，而高濃度的情況下出現(xiàn)了兩個截然相反的結果-N87受抑制/MCF-7促進，但與空白組相比扔具有極顯著的抑制作用(p＜0．01);結合圖15，與單獨使用阿霉素對照組相比，高濃度條件下會降低白血病化療的效果，這可能是由于白血病細胞也是來自骨髓，也具有利用CEJSNC的能力，而促進其增殖。所以不是任何癌癥化療后的病人食用越多越好，胃癌可以中高劑量食用，乳腺癌可以中小劑量食用，而白血病患者只能小劑量食用，這樣可兼具治療和良好的預后。

圖10 不同濃度的CEJSNC對MCF-7細胞增殖抑制的影響Fig．10 Different concentration of CEJSNC make an effect on the proliferation inhibition of MCF-7cells

圖11 不同濃度的CEJSNC對Raji細胞增殖抑制的影響Fig．11 Different concentration of CEJSNC make an effect on the proliferation inhibition of Raji cells

圖12 不同濃度的DOX對N87、MCF-7、Raji三種癌細胞的增殖抑制作用Fig．12 Different concentration of DOX make an effect on the proliferation inhibition of cancer cells(N87、MCF-7、Raji)

3 結論

本研究通過模擬消化系統(tǒng)對復方阿膠漿做了一系列的處理，獲得了易吸收的納米級微小組分CEJSNC，該組分主要成分是寡肽和氨基酸(也有多肽)，有關研究表明寡肽具有抗癌作用［10］。CEJSNC對體外培養(yǎng)的小鼠骨髓細胞的增殖促進與空白對照組相比，細胞計數(shù)有顯著性差異(p＜0．01)，與DOX聯(lián)合使用時與單用阿霉素處理的對照組相比有顯著性差異(p＜0．01)。復方阿膠漿納米級微組分對三種癌細胞具有一定的增殖抑制效果(乳腺癌更明顯)，所以正常人經(jīng)常食用可降低癌癥的發(fā)生率;然而經(jīng)與阿霉素聯(lián)合使用時，高濃度的復方阿膠漿納米級微組分會促進乳腺癌細胞的增殖而抑制胃癌的增殖，與空白組相比仍然具有顯著的增殖抑制作用(p＜0．01);由于白血病細胞是骨髓中白細胞的變異細胞，所以在化療后CEJSNC也能顯著促進其增殖(p＜0．01)，所以白血病患者應減少食用的量，以兼具治療和良好的預后。

圖13 三種不同濃度的CEJSNC與DOX聯(lián)合對N87細胞的影響Fig．13 Three different concentration of CEJSNC combined with DOX have effects on MCF-7 cell

圖14 三種不同CEJSNC與DOX聯(lián)合對MCF-7細胞的影響Fig．14 Three different concentration of CEJSNC combined with DOX have effects on MCF-7 cell

圖15 三種不同濃度CEJSNC與DOX聯(lián)合對Raji細胞的影響Fig．15 Three different concentration of CEJSNC combined with DOX have effects on MCF-7 cell

通過對CEJSNC的研究，以及探究CEJSNC對骨髓細胞和癌細胞的增殖抑制作用，為阿膠是否能作為生活保健品提供了參考;CEJSNC可直接被細胞吸收，進一步為阿膠的中藥注射劑提供了可行性依據(jù);為今后從分子機制方面探究阿膠納米級組分對不同細胞的影響提供借鑒。為阿膠抗癌保健品的研制和阿膠抗腫瘤藥物的研制提供參考。相信隨著對復方阿膠漿研究的不斷深入，復方阿膠漿更多的作用機制將得以闡述。

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