李燦嬰，葛永紅，* ，朱丹實(shí)，靳韙華

(1．渤海大學(xué)化學(xué)化工與食品安全學(xué)院，遼寧錦州121013;2．甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅蘭州730070)

由擴(kuò)展青霉(Penicillium expansum)侵染引起的青霉病是蘋果貯藏期間的主要侵染性病害之一，在貯藏中后期腐爛發(fā)生率較高［1］。目前主要依靠人工合成的殺菌劑如甲基托布津、苯來特、多菌靈等來防止果實(shí)采后病害的發(fā)生。由于殺菌劑殘留、環(huán)境污染及誘導(dǎo)病原物產(chǎn)生抗藥性等問題，因此開發(fā)新型、安全的采后病害防治技術(shù)是當(dāng)前生產(chǎn)中亟待解決的問題［2-3］。

苯丙噻重氮(acibenzolar-S-methyl，ASM)屬水楊酸類似物，其本身對(duì)病原菌生長沒有直接的抑制，而是通過激發(fā)果實(shí)體內(nèi)的系統(tǒng)抗性來提高抗病性［4］。ASM不僅可以有效地減輕蘋果、甜瓜、番茄等多種果蔬的田間病害，而且還可降低蘋果、梨、芒果、葡萄、甜瓜等果蔬的采后病害［5-7］。ASM誘導(dǎo)果實(shí)抗病性的機(jī)理主要涉及活性氧代謝、活化苯丙烷代謝及產(chǎn)生病程相關(guān)蛋白等［4］。ASM處理使鴨梨果實(shí)具有較高的苯丙氨酸解氨酶(PAL)和幾丁質(zhì)酶(CHT)活性，積累了較高水平的H2O2和酚類物質(zhì)［8］?！跋笱馈焙汀芭_(tái)農(nóng)”2個(gè)品種芒果用ASM處理后產(chǎn)生速率、H2O2含量都明顯高于對(duì)照［9］，采后ASM處理還能誘導(dǎo)甜瓜果實(shí)活性氧的積累［10］。但有關(guān)ASM處理對(duì)蘋果青霉病控制的報(bào)道很少，并且對(duì)于ASM處理后抗壞血酸-谷胱甘肽循環(huán)系統(tǒng)的變化研究不夠深入。

本實(shí)驗(yàn)以蘋果為試材，通過采后ASM浸泡處理對(duì)果實(shí)損傷接種P．expansum，測量常溫貯藏期間果實(shí)的病斑直徑，研究其對(duì)蘋果青霉病的控制效果，并探討其對(duì)抗壞血酸-谷胱甘肽循環(huán)系統(tǒng)中主要酶活性和抗氧化劑含量的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

實(shí)驗(yàn)用富士蘋果2012年9月采自景泰縣條山農(nóng)場，在八成熟時(shí)采收，紙箱包裝后當(dāng)天運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行處理。供試 ASM由 Novatis公司提供(有效濃度50%)。

P．expansum分離自自然腐爛的蘋果果實(shí)，馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)培養(yǎng)基25℃培養(yǎng)待用。

UV-2450型分光光度計(jì) 日本島津;H-1850R型離心機(jī) 長沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司;WYX-A微型旋渦混合器 上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1．2．1 處理方法 蘋果用2%次氯酸鈉浸泡消毒后用自來水沖洗凈果實(shí)表面并晾干后均分兩份，每份90個(gè)果實(shí)，然后分別用自來水(內(nèi)含 0．05%的Tween80)和 100mg·L-1的 ASM 溶液(內(nèi)含 0．05% 的Tween80)浸泡10min后撈出晾干表面水分裝箱待用。

1．2．2 孢子懸浮液的配制 參照 Bi等的方法［11］。取25℃下培養(yǎng)7d的帶菌PDA平皿一個(gè)，加入含0．05%Tween80的無菌水約10mL，用玻璃棒刮下PDA平板上的P．expansum孢子，然后轉(zhuǎn)入50mL三角瓶中，在WYX-A微型旋渦混合器上振蕩15s，再用雙層紗布過濾，濾液用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)算出孢子懸浮液的濃度，稀釋至1×105個(gè)·mL-1。

1．2．3 損傷接種 參照 Ge等的方法［7］。選取自來水和ASM處理后常溫貯藏24h的果實(shí)，經(jīng)75%酒精表面消毒后，用滅菌鐵釘在果實(shí)表面等距離刺孔4個(gè)(深3mm，直徑3mm)。取10μL孢子懸浮液分別接入孔內(nèi)。晾干后入包裝箱，室溫貯藏觀察發(fā)病率，用十字交叉法測定病斑直徑。

1．2．4 取樣 參照 Bi等的方法［11］。分別于處理后第2、4、6、8、10d 用直徑 5mm 打孔器取果實(shí)皮下10～15mm處果肉組織3g，用錫箔紙包好，液氮速凍后，在-80℃超低溫冰箱中保存待用。每次取樣用10個(gè)果實(shí)。

1．2．5 H2O2含量測定 H2O2參照 Patterson等方法并修改［12］。H2O2反應(yīng)體系包括 1mL 上清液，0．1mL 20%的四氯化鈦(溶于濃鹽酸，V/V)，0．2mL濃氨水，在508nm處測定吸光值。以H2O2溶液制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，H2O2含量以μmol H2O2·g-1FW表示。

1．2．6 過氧化氫酶(CAT)活性測定 參照Ren等方法［10］。以每分鐘 OD 值變化0．01為1U，CAT的活性表示為U·g-1FW。

1．2．7 抗壞血酸過氧化物酶(APX)活性測定 參照Nakano和Asada方法并修改［13］。酶促反應(yīng)體系由2mL 100mmol·L-1磷酸緩沖液(pH7．5，含 1mmol·L-1EDTA)，0．8mL 3mmol·L-1抗壞血酸，200μL 粗酶液和0．5mL H2O2(0．5mmol·L-1)組成，最后加入 H2O2啟動(dòng)酶促反應(yīng)。在290nm的吸光度值，連續(xù)測定2min。以每分鐘 OD值變化 0．01為 1U，酶活性表示為U·g-1FW。

1．2．8 谷胱甘肽還原酶(GR)活性測定 參照Halliwell和 Foyer方法并修改［14］。酶促反應(yīng)體系由3mL、100mmol·L-1的磷酸緩沖液，0．1mL、5mmol·L-1氧化型谷胱甘肽(GSSG)，30μL、3mmol·L-1NADPH和0．2mL酶液組成(最后加入 NADPH啟動(dòng)酶促反應(yīng))。在340nm的吸光度值，連續(xù)測定2min。以每分鐘OD值變化0．01為1U，以U·g-1FW表示。

1．2．9 單脫氫抗壞血酸還原酶(MDAR)、脫氫抗壞血酸還原酶(DHAR)活性測定 參照Nakano和Asada的方法并修改［13］。DHAR 反應(yīng)體系包含 2mL、40mmol·L-1磷酸緩沖溶液(pH8．0)，300μL、0．1mmol·L-1EDTANa2，400μL、2mmol·L-1還原型谷胱甘肽 (GSH)，400μL、0．5mmol·L-1DHA 和 100μL 粗酶液，混勻后立即記錄290nm處的OD值，以每分鐘變化0．01為1U，以U·g-1FW表示DHAR的活性。

MDAR 反應(yīng)體系包括 2mL、40mmol·L-1磷酸緩沖溶液(pH8．0)，0．2mL、10mmol·L-1抗壞血酸鈉，0．1mL、40μmol·L-1硫酸銅，0．5mL 粗酶液，最后加入0．2mL、0．2mmol·L-1NADPH 啟動(dòng)酶促反應(yīng)，混勻后立即記錄340nm處的OD值，以每分鐘OD值變化0．01為1U，以U·g-1FW表示MDAR的活性。

1．2．10 抗壞血酸(AsA)和還原型谷胱甘肽(GSH)含量測定 AsA含量測定參照Tanaka等的方法并修改［15］。反應(yīng)體系包括提取液 200μL，150mmol·L-1磷酸緩沖液(pH7．4)500μL，10%TCA 400μL，44%磷酸400μL，4%2，2-二聯(lián)吡啶(溶于 70% 乙醇)400μL，3%FeCl3200μL。反應(yīng)混合液 37℃溫浴 60min，測525nm處吸光度。標(biāo)準(zhǔn)曲線用L-AsA標(biāo)定。AsA含量以 μg AsA·g FW-1表示。

GSH含量的測定參照Ren等方法并修改［10］。反應(yīng)體系由 1mL 上清液，1mL 0．1mol·L-1的磷酸緩沖液(pH7)，0．5mL 4mmol·L-1DTNB 溶液(由 0．1mol·L-1，pH7的磷酸緩沖液配制)組成。將混合液于25℃下保溫反應(yīng)10min后，在412nm處測定吸光度值。用GSH制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，GSH含量用μmol GSH·g FW-1表示。

1.3 數(shù)據(jù)分析

全部實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用Microsoft Excel 2007以及SPSS16．0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。并計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)偏差(±SE)或進(jìn)行LSD分析。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 采后ASM處理對(duì)果實(shí)損傷接種P.expansum病斑直徑的影響

圖1 采后ASM處理對(duì)蘋果損傷接種P．expansum病斑直徑的影響Fig．1 Effect of postharvest ASM treatment on lesion diameter in apple fruit inoculated with P．expansum

ASM處理后24h接種 P．expansum，果實(shí)從接種后第3d開始明顯發(fā)病，發(fā)病率達(dá)到100%，并且隨著貯藏時(shí)間的延長病斑直徑逐漸增大，但是ASM處理果實(shí)的病斑直徑顯著低于(p≤0．05)對(duì)照，如在貯藏第 5、6d 分別低于對(duì)照 8．8%和 7．1%(圖 1)。

2.2 ASM處理對(duì)蘋果果實(shí)H2O2含量的影響

在貯藏期間蘋果果實(shí)中H2O2含量總體呈先升高后下降的趨勢(shì)，采后ASM處理明顯提高了果實(shí)H2O2含量，并且促進(jìn)了H2O2含量高峰的提前出現(xiàn)，在第6d達(dá)到最大，是對(duì)照的1．34倍(圖2)。

圖2 采后ASM處理對(duì)果實(shí)H2O2含量的影響Fig．2 Effect of postharvest ASM treatment on the content of H2O2

2.3 ASM處理對(duì)蘋果果實(shí)CAT活性的影響

對(duì)照蘋果果實(shí)在貯藏期CAT活性呈先緩慢升高后下降趨勢(shì)，ASM處理抑制了果實(shí)CAT活性的升高，在整個(gè)貯藏期均低于對(duì)照(圖3)，如貯藏第4d，處理果實(shí)CAT活性低于對(duì)照24．8%。

2.4 ASM處理對(duì)蘋果果實(shí)APX活性和AsA含量的影響

在整個(gè)貯藏期間，APX活性呈先上升后下降趨勢(shì)，并且ASM處理顯著提高了果實(shí)APX活性，貯藏第6d出現(xiàn)高峰(圖4A)。由圖4B可知，采后ASM處理顯著增加了果實(shí)中AsA含量，并且在貯藏第6d達(dá)到最大，而對(duì)照果實(shí)AsA含量沒有明顯的高峰出現(xiàn)。

2.5 ASM處理對(duì)蘋果果實(shí)MDAR和DHAR活性的影響

圖3 采后ASM處理對(duì)蘋果果實(shí)CAT活性的影響Fig．3 Effect of postharvest ASM treatment on the activity of CAT

圖4 采后ASM處理對(duì)果實(shí)APX(A)活性和AsA(B)含量的影響Fig．4 Effect of postharvest ASM treatment on APX(A)activity and AsA(B)content

隨著貯藏時(shí)間的延長，對(duì)照和ASM處理蘋果果實(shí)中MDAR活性呈先升高后下降趨勢(shì)，ASM處理顯著提高了MDAR活性，并且在第4d達(dá)到最大，高出對(duì)照23．1%(圖 5A)。DHAR活性的變化趨勢(shì)和MDAR基本一致，ASM處理顯著提高了蘋果果實(shí)中DHAR活性，在貯藏第6d達(dá)到最大，高出對(duì)照28．2%(圖5B)。

2.6 ASM處理對(duì)蘋果果實(shí)GR活性和GSH含量的影響

GR活性總體呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，ASM處理明顯提高了蘋果果實(shí)GR活性，并且在貯藏第6d達(dá)到最大(圖6A)。對(duì)照和ASM處理果實(shí)GSH含量均呈先上升然后緩慢下降的趨勢(shì)，處理果實(shí)在貯藏第6d達(dá)到最大，GSH含量是對(duì)照的1．24倍(圖6B)。

3 討論

圖5 采后ASM處理對(duì)果實(shí)MDAR(A)和DHAR(B)活性的影響Fig．5 Effect of postharvest ASM treatment on MDAR(A)and DHAR(B)activities

圖6 采后ASM處理對(duì)果實(shí)GR(A)活性和GSH(B)含量的影響Fig．6 Effect of postharvest ASM treatment on the activity of GR(A)and GSH(B)content

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)采后100mg·L-1ASM處理顯著降低了蘋果果實(shí)損傷接種P．expansum的病斑直徑，這種抗病性的提高可能與ASM誘導(dǎo)的果實(shí)體內(nèi)活性氧代謝有關(guān)。研究表明，ASM 處理誘導(dǎo)了梨［8］、桃［16］、甜瓜［10］、芒果［17］等果實(shí)的抗病性，并且促進(jìn)了活性氧的積累。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)采后ASM處理誘導(dǎo)了蘋果果實(shí)體內(nèi)H2O2含量的提高，并且抑制了CAT活性。在梨、甜瓜桃、芒果等果實(shí)體內(nèi)也發(fā)現(xiàn)了類似的現(xiàn)象［10，16-18］。ASM 誘導(dǎo)的 H2O2的積累主要發(fā)生在處理后的早期，其積累與細(xì)胞膜的完整性密切相關(guān)，并且含量受果實(shí)體內(nèi)抗氧化酶和抗氧化劑含量的影響［10，16-17，19］。CAT 可以專一地作用于 H2O2，將 H2O2分解為H2O和O［20］2，本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，ASM處理抑制了果實(shí)CAT活性，從而促進(jìn)了果實(shí)體內(nèi)H2O2的積累。果實(shí)體內(nèi)H2O2含量的提高有以下幾方面的作用，可以直接殺死侵染的病原物，作為信號(hào)分子啟動(dòng)其他防衛(wèi)反應(yīng)，參與細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)的木質(zhì)化及結(jié)構(gòu)蛋白的交聯(lián)等。

AsA-GSH循環(huán)是果實(shí)體內(nèi)直接清除ROS的酶促催化系統(tǒng)，在此過程中，APX以AsA為基質(zhì)將H2O2轉(zhuǎn)變成H2O，同時(shí)產(chǎn)生兩分子活潑的MDHA，MDHA在 MDHAR存在時(shí)可以還原為 AsA，同時(shí)MDHA又能夠進(jìn)一步氧化形成 DHA，而 DHA在DHAR存在的情況下能夠以GSH為底物又還原成AsA，同時(shí) GSH被氧化為 GSSG，GSSG又可以以NADPH為電子供體，通過GR的催化再重新還原成GSH，因而APX和GR是此循環(huán)中的兩個(gè)關(guān)鍵酶，可以保持果實(shí)體內(nèi)AsA和GSH的平衡，并在抗氧化系統(tǒng)中發(fā)揮著重要的作用［21-22］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，ASM處理提高了果實(shí)APX和GR活性，從而提高了果實(shí)活性氧的清除能力。AsA和GSH是AsA-GSH循環(huán)中兩個(gè)重要的抗氧化物質(zhì)，本身具有直接清除ROS的作用［21-22］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，ASM處理能夠使果實(shí)的AsA和GSH含量保持在相對(duì)較高的水平，并且保持了較高的MDAR和DHAR活性，從而促進(jìn)了AsA-GSH循環(huán)運(yùn)轉(zhuǎn)的效率，有效維持了AsA和GSH的循環(huán)系統(tǒng)，進(jìn)而維持了較高抗氧化能力，使過量的ROS能夠及時(shí)的被清除。

4 結(jié)論

采后100mg·L-1ASM處理顯著降低損傷接種蘋果果實(shí)P．expansum的病斑直徑，抑制了果實(shí)體內(nèi)CAT活性，從而提高果實(shí)H2O2含量。同時(shí)ASM處理通過提高AsA-GSH循環(huán)系統(tǒng)中抗氧化酶活性和抗氧化劑水平消除過量H2O2對(duì)果實(shí)傷害。

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