王 剛，孫媛媛，唐曉姝，張秋香，印伯星，房東升，張 灝，陳 衛(wèi)，2，*

(1．江南大學食品學院，江蘇無錫214122;2．江南大學食品科學與技術國家重點實驗室江蘇無錫214122;3．揚州市揚大康源乳業(yè)有限公司，江蘇揚州225004)

環(huán)境激素是由于人類的生產及活動而釋放到周圍環(huán)境中，能夠影響人類或動物的內分泌、神經(jīng)和免疫系統(tǒng)等，從而導致其生殖、發(fā)育異常甚至惡性腫瘤發(fā)生等異常生物學效應的一類環(huán)境污染物［1-6］。1996年歐盟首次將環(huán)境激素分為5大類，其中類固醇類雌激素是一類生物活性最強的環(huán)境激素［7］。雌激素可以分為天然雌激素和人工合成雌激素兩大類:天然雌激素主要來源于人體和哺乳動物，又稱為內源性雌激素，主要包括雌酮(estrone，E1)、雌二醇(estradiol，E2)和雌三醇(estriol，E3)等;人工合成雌激素以己烯雌酚(diethylstibestrol，DES)為代表。雌激素類藥物在畜禽養(yǎng)殖中具有通過蛋白質同化作用提高食欲的功效，曾被用來提高飼料轉化率，促進動物生長。但由于人工合成雌激素具有致癌作用，美國和加拿大已限量使用，而歐盟則禁止使用［8-9］。我國也于2002年發(fā)布《中華人民共和國農業(yè)部公告第235號》，明確將DES及其鹽列為禁止使用的藥物，在動物性食品中不得檢出［10］。然而現(xiàn)階段雌激素在動物養(yǎng)殖過程中濫用的情況時有發(fā)生，畜禽類產品中的雌激素殘留已經(jīng)成為一個日益嚴重的食品安全問題。因此，對畜禽產品中雌激素的含量進行檢測很有必要。

雌激素檢測的傳統(tǒng)方法通常有免疫法［11］、液相色譜串聯(lián)質譜法［12］、氣相色譜串聯(lián)質譜法［13］等。本實驗室曾建立了用分散固相萃取方法(DSPE)前處理、液相色譜串聯(lián)四級桿質譜(LC-MS/MS)測定牛奶及酸奶中雌激素含量的檢測方法(DSPE-LC-MS/MS)［14］。本研究在此基礎上，進一步使用該方法對部分畜禽產品中4種雌激素的殘留進行了分析。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

雌酮(E1)、雌二醇(E2，96．7%)、雌三醇(E3，97．4%)、己烯雌酚(DES，99．9%) 中國藥品生物制品檢定所;乙腈、甲醇、醋酸(色譜純)Tedia公司;分析純無水硫酸鈉、無水硫酸鎂、氯化鈉，弗羅里硅土(Florisil，60-100 目)，中性氧化鋁(Alumina-N，100-200目):國藥集團;N-丙基乙二胺(PSA)Agilent公司;雞肉、牛肉、豬肉、雞肝及雞蛋等 當?shù)厥袌觥?/p>

超高效液相-串聯(lián)四級桿質譜儀(UPLC-TQD)及 ACQUITY BEH C18柱(1．7μm，100mm × 2．1mm)美國Waters公司;超聲儀(SB4200DT) 寧波新芝生物技術;電子天平 EL3002(d=0．01g)、分析天平AB103-N(d=0．0001g) 瑞士Mettler Toledo公司;超速離心機(D-78532) 德國Hettich公司;小型高速離心機(5415R) 德國Eppendorf公司;九陽攪拌機(JYL-C020) 九陽股份有限公司。

1.2 實驗方法

標準溶液配制:分別精確稱取 E1、E2、E3、DES各2mg置于5mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容，配制成終濃度為400mg/L的單標儲備液，-20℃保存;為達到快速檢測的目的，將4種單標儲備液按一定比例混合配成混合標準液，以繪制標準曲線。由于質譜儀對4種雌激素的響應值不同，通過調整將單標儲備液按比例 E1∶E2∶E3∶DES=2∶8∶8∶1 混合，以保證4種雌激素的峰面積在同一數(shù)量級上。

樣品制備:稱取剔除骨、皮的動物肌肉組織及內臟樣本200g，用家用攪拌器進行攪拌粉碎，-20℃密封保存;雞蛋只需于實驗前去蛋殼，將蛋清與蛋黃打碎攪勻。向攪碎的畜禽產品中添加不同濃度的混合標準液(每種濃度做6組平行)，充分攪拌均勻后超聲5min;取4．00g樣品置于50mL聚丙烯離心管中，加入8mL乙腈，渦旋振蕩5min后并于室溫下超聲20min 以充分萃取;加入 0．05g NaCl和 1．60g 無水MgSO4，渦旋振蕩1min，8000r/min、4℃離心10min;取1mL上清至1．5mL離心管中，加入80mg PSA，渦旋振蕩 1min，6000r/min、4℃離心 6min，上清液經(jīng) 0．22μm微孔濾膜過濾，濾液用LC-MS/MS測定。

液相色譜條件［14］:色譜柱:ACQUITY BEH C18(1．7μm，100mm × 2．1mm);流動相:1% 醋酸銨溶液(A)和甲醇(B);采用梯度洗脫程序:0～0．3min，90%A，10%B(保持 0．2min);0．5～2min，10%A，90%B;2～3min，0% A，100% B(保 持 2min);流 速:0．3mL/min;進樣體積:2μL。

質譜條件［14］:電離方式:ESI-;霧化器壓力:310．3kPa;離子噴霧電壓:4000V;干燥器(N2)流速:650L/min;柱溫:40℃;離子源溫度:120℃;檢測以多反應監(jiān)測(MRM)方式掃描;4種雌激素經(jīng)優(yōu)化后的質譜分析參數(shù)見表1。

表1 4種雌激素質譜分析參數(shù)Table 1 MS/MS parameters of 4 estrogens

數(shù)據(jù)處理:作圖及實驗數(shù)據(jù)統(tǒng)計、分析均使用Microsoft office Excel 2013。

2 結果與討論

2.1 樣品前處理條件的選擇

萃取劑與其用量對回收率的影響:同處理牛奶及酸奶樣品結果相似［14］，當分別使用乙腈和甲醇以沉淀畜禽產品中的蛋白質并萃取雌激素時，甲醇處理后的樣品離心分層效果不明顯，上清液較渾濁;而乙腈萃取的樣品分層效果明顯，上清液清澈。因此本實驗的萃取溶劑仍選擇乙腈。經(jīng)調整，當使用8mL乙腈處理4．0g畜禽樣品時，萃取液可達澄清且足夠檢測。

吸水劑及其用量對回收率的影響:本研究發(fā)現(xiàn)在雞肉中以無水MgSO4作為吸水劑時，4種雌激素的回收率要明顯高于使用相同量的無水Na2SO4作為吸水劑(結果未顯示)。因此選擇無水MgSO4作為樣品制備時的吸水劑并進一步對雞肉樣品中無水MgSO4的最適加入量進行了研究。如圖1所示，在4．0 g雞肉樣品中加入0．05g NaCl及不同量的無水MgSO4，分別檢測其回收率。結果顯示當加入 1．60g無水MgSO4時，4種雌激素的回收率最高，隨著無水MgSO4含量的增加，回收率幾乎保持不變或稍稍有所下降。因此在本研究中每4．00g畜禽產品中無水MgSO4的添加量定為 1．60g。

圖1 添加無水MgSO4對回收率的影響Fig．1 Effect of MgSO4amount on the recovery of 4 estrogens

固相分散吸附劑對回收率的影響:本研究分別以PSA、Florisil和Alumina-N作為固相分散吸附劑檢測了其對雞肉中雌激素回收率的影響。同牛奶中的情況一致，PSA處理過的樣品明顯澄清于用Florisil和Alumina-N處理的樣品(結果未顯示)。因此，選擇PSA作為分散固相吸附劑。

2.2 流動相選擇及質譜條件優(yōu)化

由于檢測的雌激素相同，本研究沿用了在檢測牛奶及酸奶中雌激素的流動相參數(shù)以及質譜條件［14］。流動相具體參數(shù)為:體積分數(shù)為1%的醋酸銨水溶液和甲醇溶液。

2.3 基質效應

為了評估畜禽產品基質對雌激素檢測的影響，本實驗在質譜分析中比較了加標雞肝、雞肉、牛肉及雞蛋等樣品的響應值(a)與加標純水的響應值(b)的比率(a/b×100，%)。當該比值等于100%時，說明待測物無基質效應;如果比值小于100%，說明基質對待測物的離子響應產生了抑制作用;若比值大于100%，則說明基質的存在增強了待測物的離子響應強度［15］。由表 2可見，4種雌激素的響應比率為90．16%～99．01%，均在 90%以上。畜禽產品基質對4種雌激素的離子響應均只產生了微弱的抑制作用［15］。

表2 4種雌激素在不同樣品中的基質效應Table 2 Matrix effects of animal products on 4 estrogens

2.4 線性范圍、標準曲線和檢出限

以雌激素的質量濃度為X(μg/L)，以目標組分的峰面積為Y(S)作標準曲線，得到4種雌激素對應的線性方程及相關系數(shù)。如表3所示，各校準曲線相關系數(shù)的平方值(R2)均大于0．99，4種雌激素的質量濃度在8～1500μg/L具有良好的線性關系。以信噪比為3(S/N=3)時，最低檢出限(LOD)可達到0．66μg/L，根據(jù)樣品處理方式(樣品∶乙腈 =1∶2)折算至畜禽產品各雌激素最低檢出限為:LOD(E1)=8．06μg/kg，LOD(E2)=16．52μg/kg，LOD(E3)=5．86μg/kg，LOD(DES)=1．32μg/kg。

表3 4種雌激素的線性方程、相關系數(shù)、檢出限和線性范圍Table 3 Regression equation，correlation coefficient(R2)，detection limits and linear range of 4 estrogens

2.5 回收率與精密度

在雞肝、雞肉和牛肉樣品中分別添加3個濃度水平的4種雌激素混合標準液，每個添加濃度重復測定6次，計算添加回收率和測定結果的相對標準偏差(表4)。雞肝中4種雌激素的回收率為75．00%～79．13% ，相對標準偏差為 0．47% ～8．82%;雞肉中 4種雌激素的回收率為77．40%～81．28%，相對標準偏差為0．42%～6．57%;牛肉中4種雌激素的回收率為75．25% ～80．61% ，相對標準偏差為 0．24% ～6．25%;雞蛋中4種雌激素的回收率為92．36%～96．63%，相對標準偏差為0．21%～2．06%。采用本方法檢測，雌激素在禽蛋中的回收率最高可達96．63%，而在基質更為復雜的畜禽肉類中雌激素的回收率也均在75%以上，參照畜肉產品中其他物質的檢測［16-18］，本方法基本能夠滿足畜禽產品中E1、E2、E3、DES檢測的要求。

2.6 實際樣品檢測

取不同批次和種類的畜禽產品(每種樣品樣本數(shù)≥5)，按照實驗方法1．2中“樣品制備”進行樣品前處理操作(不添加混合標準液)，運用LC-MS/MS進行分析，計算各樣品中4種雌激素殘留量的平均值，結果見表5。從表格中可以看到:E1在各樣品中均無檢出，雞蛋和豬肉中檢測出微量的E2和E3，在所有樣品中均未檢出人工合成雌激素DES。天然雌激素主要來源于卵巢的卵泡顆粒細胞和卵泡內膜細胞。在動物體內，E2活性最強、含量最多，在體內代謝后轉化為E1和 E3，一般動物肌肉中的平均自然濃度約為10ng/g［19］。本實驗所收集樣品中檢測到的E2，E3含量均在天然濃度范圍內，且未檢測到人工合成雌激素DES，可以排除飼養(yǎng)過程中人為添加雌激素的情況。

表4 4種雌激素在雞肝、雞肉、牛肉和雞蛋中的加標回收率和相對標準偏差(n=6)Table 4 Spiked recoveries and RSD of 4 estrogens in chicken liver，chicken，beef and egg(n=6)

表5 樣品中4種雌激素含量測定Table 5 4 estrogens content in the animal products on market

3 結論

本研究利用實驗室建立的在牛奶及酸奶中檢測雌激素含量的DSPE-LC-MS/MS分析方法對畜禽產品包括雞肉、雞肝、雞蛋、牛肉及豬肉中的4種雌激素進行了檢測，取得了較為滿意的結果。該檢測手段采用DSPE前處理方法，操作簡便、無需特殊設備，對于畜禽產品中雌激素的提取凈化效果較好，回收率較高，所得樣品經(jīng)液相色譜質譜聯(lián)用檢測靈敏度高、無明顯基質效應。該方法可用于畜禽產品中E1、E2、E3以及DES等雌激素的殘留檢測。

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