王 超，杜 冰，謝藍(lán)華，張嘉怡，林鳳英，楊公明

(華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，廣東廣州510642)

黃芪是豆科植物蒙古黃芪或膜莢黃芪的根［1］。黃芪的主要生理活性物質(zhì)有多糖、類黃酮、皂苷三大類［2］，黃酮類化合物具有抗氧化、抗腫瘤、延緩衰老及降血糖、降血壓、降血脂、抗炎鎮(zhèn)痛等作用［3-4］，因而受到國內(nèi)外的廣泛關(guān)注。目前，黃芪黃酮類化合物的主要提取方法有:超聲提取法［5］、有機(jī)溶劑提取法［6］、纖維素酶提取法［7］、閃式提取法［8］等，應(yīng)用最為廣泛的是有機(jī)溶劑提取法，由于植物類黃酮存在于細(xì)胞內(nèi)，常規(guī)的乙醇提取法無法使細(xì)胞壁完全破裂，類黃酮的溶出存在較大阻力，造成得率低和提取成本較高。

近年來，國內(nèi)外已有利用表面活性劑的增溶作用協(xié)同提取天然產(chǎn)物活性成分的研究，該法通常是以溶有少量表面活性劑的水替代高質(zhì)量分?jǐn)?shù)的醇或其他有機(jī)溶劑進(jìn)行活性成分的提取，能大大降低提取成本，并提高得率［9-10］。此外，表面活性劑對木質(zhì)素具有吸附作用，可以阻止纖維素酶與木質(zhì)素的無效結(jié)合［11］，對纖維素酶具有穩(wěn)定效應(yīng)，在水解過程中可有效阻止纖維素酶的變性［12］，從而提高纖維素酶的水解效率。

本文在常規(guī)的乙醇提取法之前，對黃芪進(jìn)行表面活性劑輔助酶預(yù)處理，在單因素實驗的基礎(chǔ)上，采用Box-Behnken的中心組合實驗，并且利用Design-Expert8．0軟件進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化分析，確定黃芪黃酮的最佳提取工藝參數(shù)，以期為黃芪深加工提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

蒙古黃芪藥材 內(nèi)蒙古烏蘭察布市廣一中藥材種植有限公司提供;纖維素酶(酶活力≥6200IU/g)廣州柏棠貿(mào)易有限公司;蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品 Sigma公司;亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、乙醇、冰醋酸、無水乙酸鈉、十二烷基硫酸鈉(SDS)、溴化十六烷基三甲胺(CTMAB)、吐溫-80、吐溫-20、十二烷基苯磺酸鈉(LAS) 分析純，廣州化學(xué)試劑廠。

液氮粉碎機(jī) 華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院中低溫加工研究中心研制;JA-2003型電子分析天平 賽多利斯科學(xué)儀器有限公司;722E型紫外可見分光光度計 上海光譜儀器有限公司;101-1AB型電熱鼓風(fēng)干燥箱 天津太斯特儀器有限公司;電熱恒溫水浴鍋 金壇市精達(dá)儀器制造廠;PHS-3C酸度計 上海理達(dá)儀器廠;HJ-3型恒溫磁力攪拌器 鞏義市英峪予華儀器廠;SHZ-Ⅲ型循環(huán)水真空抽慮機(jī) 上海亞榮生化儀器廠。

1.2 實驗方法

1．2．1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作 根據(jù)文獻(xiàn)［13］，將蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品于105℃干燥至恒重后，精密稱取20mg用80%乙醇溶解，定容至100mL，得濃度為0．200mg/mL蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液。準(zhǔn)確吸取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液 0、1．0、2．0、3．0、4．0、5．0、6．0mL 于25mL 容量瓶中，加入5%NaNO2溶液0．3mL，搖勻放置 6min 后加入 10%Al(NO3)3溶液0．3mL，搖勻放置 6min后加入 4%NaOH溶液4mL，用80%乙醇溶液定容，搖勻，10min后用1cm比色皿于510nm測定吸光度A。

1．2．2 總黃酮含量的測定 按照測定蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液吸光度的步驟測定吸光度X，計算黃芪黃酮的含量，重復(fù)3次，取平均值。黃芪黃酮得率按下列公式計算。

式中:C為由標(biāo)準(zhǔn)曲線計算得出的樣品的黃酮濃度，mg/mL;V為樣品溶液的體積，mL;D為樣品的總稀釋倍數(shù);m為樣品的質(zhì)量，mg。

1．2．3 黃芪黃酮提取工藝 黃芪烘干、經(jīng)液氮粉碎機(jī)粉碎后過60目篩。準(zhǔn)確稱取黃芪干粉5．000g，在pH4．0，溫度50℃的條件下經(jīng)不同表面活性劑、一定質(zhì)量的纖維素酶處理1h，升溫滅酶;抽濾，蒸發(fā)濃縮得濾液A，濾渣加一定濃度的乙醇溶液30mL并調(diào)pH至7，一定溫度下提取一段時間后，抽濾，蒸發(fā)濃縮得濾液B，濾渣用同濃度的乙醇溶液洗滌3次，得濾液C，合并濾液，用同濃度乙醇溶液定容至100mL。

1．2．4 單因素實驗設(shè)計 在表面活性劑添加量0．2%、酶添加量 0．2%、乙醇濃度 80%、提取溫度80℃、提取時間2h的條件下，考察表面活性劑十六烷基硫酸鈉(SDS)、溴化十六烷基三甲胺(CTMAB)、十六烷基苯磺酸鈉(LAS)、吐溫-80、吐溫-20對黃芪黃酮得率的影響;在溴化十六烷基三甲胺添加量0．2%、乙醇濃度80%、提取溫度80℃、提取時間2h的條件下，考察酶添加量 0．1% 、0．2% 、0．3% 、0．4% 、0．5%對黃芪黃酮得率的影響;在溴化十六烷基三甲胺添加量0．2%、酶添加量0．2%、提取溫度80℃、提取時間2h的條件下，考察乙醇濃度 50%、60%、70%、80%、90%對黃芪黃酮得率的影響;在溴化十六烷基三甲胺添加量0．2%、酶添加量0．2%、乙醇濃度80%、提取時間2h的條件下，考察提取溫度50、60、70、80、90℃對黃芪黃酮得率的影響;在溴化十六烷基三甲胺添加量0．2%、酶添加量0．2%、乙醇濃度80%、提取溫度80℃的條件下，考察提取時間0．5、1．0、1．5、2．0、2．5h 對黃芪黃酮得率的影響。

1．2．5 響應(yīng)面分析與優(yōu)化設(shè)計 根據(jù)單因素實驗結(jié)果，對影響黃酮得率較為明顯的提取溫度(A)、乙醇濃度(B)、溴化十六烷基三甲胺添加量(C)三個因素，采用Box-Behnken中心組合實驗，設(shè)計三因素三水平中心組合實驗，利用Design-Expert8．0軟件進(jìn)行響應(yīng)面分析，建立多元二次回歸方程，確定黃芪黃酮的最佳提取工藝條件。

表1 三因素三水平中心組合實驗因素水平編碼表Table 1 Three factors and three levels of central composite experiment factor level table

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實驗

2．1．1 標(biāo)準(zhǔn)曲線 按照 1．2．1 方法，得到蘆丁濃度Y(mg/mL)與吸光度 X的回歸方程:Y=8．645X-0．003，相關(guān)系數(shù) R2=0．9993，蘆丁濃度在 0～0．048mg/mL范圍內(nèi)，吸光度與蘆丁濃度呈良好線性關(guān)系。

2．1．2 表面活性劑種類對黃酮得率的影響 由圖1可知，表面活性劑種類對黃芪黃酮得率有明顯影響，原因可能是不同表面活性劑對木質(zhì)纖維素中的木質(zhì)素的吸附作用力不同，阻止了酶與木質(zhì)素的無效結(jié)合，或是在溶液中形成不同的分子聚合體改變了黃酮的溶解性，其中溴化十六烷基三甲胺添加量在黃芪黃酮的提取過程中所起促進(jìn)作用最明顯，因此，選擇溴化十六烷基三甲胺進(jìn)行下一步實驗。

2．1．3 溴化十六烷基三甲胺添加量對黃酮得率的影響 由圖2可知，隨著溴化十六烷基三甲胺添加量的增加，黃酮得率隨之提高。在溴化十六烷基三甲胺添加量0．1%～0．3%時黃酮得率增加較明顯，隨后變化趨于平緩。結(jié)果表明，隨著溴化十六烷基三甲胺添加量增加，得率逐漸上升，并在0．4%～0．5%達(dá)到平衡，因此，選擇溴化十六烷基三甲胺添加量為0．4% 為宜。

2．1．4 酶添加量對黃酮得率的影響 由圖3可以看出，隨著纖維素酶添加量的增加，黃酮得率略有上升。在酶添加量為0．2%時，黃酮得率達(dá)到較大值(3．981%)，之后繼續(xù)加大酶添加量，得率提高不顯著，考慮提取成本問題，選擇纖維素酶添加量0．2%為宜。

圖2 溴化十六烷基三甲胺添加量對黃酮得率的影響Fig．2 Effects of surfactant addition on the yield of flavonoids

圖3 酶添加量對黃酮得率的影響Fig．3 Effects of enzyme addition on the yield of flavonoids

2．1．5 提取溫度對黃酮得率的影響 由圖4可以看出，提取溫度對黃芪黃酮得率有明顯影響。在一定范圍內(nèi)，黃酮得率隨提取溫度的增大而先增加后降低。在提取溫度為80℃時，黃酮得率達(dá)到最高值(4．127%)，之后得率略有降低。原因可能是過高的溫度使黃酮分解，從而使黃酮得率降低。因此，提取溫度選取80℃為宜。

圖4 提取溫度對黃酮得率的影響Fig．4 Effect of extracting temperature on the yield of flavonoids

2．1．6 提取時間對黃酮得率的影響 由圖5可以看出，提取時間對黃酮得率有明顯影響，隨著提取時間的延長，黃酮得率呈現(xiàn)逐漸上升的趨勢，2h時黃酮得率達(dá)到最高點(4．172%)。提取的傳質(zhì)過程，需要一定時間才能達(dá)到平衡，時間太短，還未達(dá)到平衡，黃酮得率偏低;當(dāng)傳質(zhì)過程達(dá)到基本平衡后，隨著提取時間的延長，可能導(dǎo)致黃酮類物質(zhì)熱分解損失。因此，提取時間選擇2h為宜。

圖5 提取時間對黃酮得率的影響Fig．5 Effect of extracting time on the yield of flavonoids

2．1．7 乙醇濃度對黃酮得率的影響 由圖6可以看出，隨著乙醇濃度的增大，黃芪黃酮得率逐漸升高，乙醇濃度為80%時，黃酮得率達(dá)最大，但當(dāng)乙醇濃度超過80%時，得率有所下降，這說明乙醇濃度較低時不利于黃酮類物質(zhì)的溶出，而乙醇濃度過大時，蛋白質(zhì)，糖類等大分子會發(fā)生凝聚，阻塞內(nèi)部組織的孔道，使黃酮類化合物擴(kuò)散的阻力增加。因此確定乙醇溶液的適宜濃度為80%。

圖6 乙醇濃度對黃酮得率的影響Fig．6 Effect of ethanol concentration on the yield of flavonoids

2.2 回歸模型的建立與分析

根據(jù)單因素實驗結(jié)果，利用Box-Behnken中心組合實驗的設(shè)計原理［14］，設(shè)計了乙醇濃度、提取溫度、溴化十六烷基三甲胺添加量三因素三水平共15個實驗點的響應(yīng)分析實驗。

利用Design-Expert8．0軟件進(jìn)行乙醇濃度、提取溫度、溴化十六烷基三甲胺添加量三個因素對黃芪黃酮得率的回歸分析，建立三元二次回歸方程:

Y=4．26+0．08A+0．033B-5．00E-003C+0．08AB+0．13AC+0．095BC-0．19A2-0．29B2-0．21C2(R2=0．9779)

運用Design Expert8．0軟件對15個實驗點的響應(yīng)值進(jìn)行方差分析，見表3。

由表3可以看出，回歸模型是極顯著的(p=0．0001 ＜0．01)，同時該模型具有較高的相關(guān)系數(shù)(R2=0．9779)，擬合度大于97%。說明該模型能夠反映響應(yīng)值的變化，而且方程的失擬項很小，說明該方程對試驗擬合情況好、誤差小，因此可以用該回歸方程代替試驗真實點對試驗結(jié)果進(jìn)行分析和預(yù)測。

表3 方差分析表Table 3 Variance analysis for regression equation

表2 三因素三水平中心組合實驗方案與結(jié)果Table 2 Three factors and three levels of central composite experiment factor level table

2.3 響應(yīng)面實驗交互因素分析

通過Design Expert 8．0軟件分析，將三因素兩兩進(jìn)行分析比較，做出響應(yīng)面曲線圖。由圖7～圖9可以看出，溫度相較于乙醇濃度、溴化十六烷基三甲胺添加量的曲線較陡峭，說明溫度對于黃酮提取的影響較顯著些;溫度固定時，乙醇濃度的曲線比溴化十六烷基三甲胺添加量的陡峭，再一次驗證了黃芪黃酮提取過程中，乙醇濃度的影響比溴化十六烷基三甲胺添加量的大。

圖7 提取溫度與乙醇濃度對黃酮得率影響Fig．7 Interaction effects of extracting temperature and ethanol concentration on the yield of flavonoids

圖8 乙醇濃度與溴化十六烷基三甲胺添加量對黃酮得率影響Fig．8 Interaction effects of ethanol concentration and CTMAB addition on the yield of flavonoids

等高線即為響應(yīng)面圖在底面的投影，其形狀反映了交互影響的強弱大小。等高線趨于圓形時，兩因素的交互作用相對較弱;等高線呈橢圓形時，兩因素的交互作用相對較強［15］。由圖可知，乙醇濃度和溴化十六烷基三甲胺添加量等高線趨于圓形，說明在某一因素取最佳值，其他兩因子的交互作用為差異顯著。乙醇濃度和提取溫度的等高線、提取溫度和溴化十六烷基三甲胺添加量等高線為橢圓形，說明這兩組因素的交互作用顯著。

圖9 提取溫度與溴化十六烷基三甲胺添加量對黃酮得率影響Fig．9 Interaction effects of extracting temperature and CTMAB addition on the yield of flavonoids

由回歸方程可知，表面活性劑輔助酶解提取黃芪黃酮最優(yōu)工藝條件為:提取溫度78．87℃，乙醇濃度79．73%，溴化十六烷基三甲胺添加量0．37%，在該條件下，黃芪黃酮的得率的理論值達(dá)4．287%?？紤]到實際操作情況，將表面活性劑輔助酶解提取黃芪黃酮工藝條件優(yōu)化為提取溫度79℃，乙醇濃度80%，溴化十六烷基三甲胺添加量為0．37%。在此工藝條件下，進(jìn)行3次驗證實驗，黃芪黃酮的平均得率為4．192%。

3 結(jié)論與討論

3.1 在單因素實驗結(jié)果的基礎(chǔ)上，根據(jù) Box-Behnken的中心組合實驗設(shè)計原理，設(shè)計三因素三水平實驗，利用Design-Expert8．0軟件進(jìn)行響應(yīng)面分析，建立了黃芪黃酮提取的三元二次回歸方程，經(jīng)檢驗該回歸方程是合理可靠的，能夠較好的預(yù)測黃芪黃酮的得率。優(yōu)化得出黃芪黃酮的最佳提取工藝條件為溴化十六烷基三甲胺添加量0．37%，乙醇濃度80%，提取溫度79℃，在此條件下黃酮得率實測值可達(dá) 4．192%，與理論值(4．287%)基本吻合，充分驗證了該模型的可靠性。

3.2 本文采用表面活性劑輔助酶法預(yù)處理提取法，該方法目前尚無文獻(xiàn)報道，可以拓展為一種中藥有效成分提取的新方法。與傳統(tǒng)提取方法相比，具有選擇性高、能耗低、排污量少等優(yōu)點，與閃式提取法、超聲波提取法相比，適用面更廣，且設(shè)備簡單，有效成分得率顯著提高，符合當(dāng)今綠色化學(xué)的潮流，對黃芪的進(jìn)一步開發(fā)利用具有重要現(xiàn)實意義。

3.3 本文將表面活性劑輔助酶法預(yù)處理與有機(jī)溶劑提取相結(jié)合，提高了酶的水解效率，最大程度地釋放有效成分。另外，由于表面活性劑的分子結(jié)構(gòu)具有兩親性，可降低物質(zhì)之間的界面張力，使溶劑分子更易滲入顆粒中，從而提高有效成分的提取效率。但該方法還處于實驗室研究階段，還未應(yīng)用于實際生產(chǎn)中，在以后的工作中需要對表面活性劑的殘留問題以及產(chǎn)物的安全性進(jìn)行深入的研究。

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