劉利霞，趙 旭，王 勃，劉 賀，惠麗娟，何余堂，馬 濤，*

(1．沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，遼寧沈陽(yáng)110866;2．遼寧省糧食科學(xué)研究所，遼寧沈陽(yáng)110866;3．渤海大學(xué)化學(xué)化工與食品安全學(xué)院，遼寧錦州121013)

稻谷脫殼即為糙米，糙米經(jīng)過(guò)適宜的發(fā)芽，富含纖維的皮層被部分酶解發(fā)生組織軟化，其吸水性和膨脹性改善，食用品質(zhì)提高。研究表明，糙米發(fā)芽之后大量生理活性成分增加，其中γ-氨基丁酸的含量是發(fā)芽前的5倍［1］，γ-氨基丁酸是一種廣泛分布在動(dòng)植物體內(nèi)的非蛋白質(zhì)氨基酸，通常被認(rèn)為有改善健康的效果［2］，具有降低血壓、促進(jìn)睡眠，增強(qiáng)記憶力、預(yù)防與治療癲癇、解毒等功效［3］。因此，提高發(fā)芽糙米GABA含量的研究引起國(guó)內(nèi)外研究者們的廣泛關(guān)注。

脈沖強(qiáng)光技術(shù)主要是作為一種非熱殺菌技術(shù)應(yīng)用在食品原料的處理中。目前，脈沖強(qiáng)光技術(shù)在食品中的應(yīng)用研究多集中于固體食品的表面殺菌，主要研究有糧油制品［4］、果蔬［5］、奶制品［6］等殺菌方面。Uesugi和Moraru［7］的研究表明脈沖強(qiáng)光能顯著降低香腸中單細(xì)胞增生李斯特菌的數(shù)量。Oms-Oliu和Aguiló-Aguayo［8］等人研究了脈沖強(qiáng)光處理對(duì)鮮切蘑菇質(zhì)量和抗氧化性質(zhì)的影響;馬鳳鳴［9］研究了脈沖強(qiáng)光對(duì)梨多酚氧化酶的影響;馬濤［13］采用脈沖強(qiáng)光制備發(fā)芽糙米的方法發(fā)明專(zhuān)利說(shuō)明脈沖強(qiáng)光對(duì)制備發(fā)芽糙米有一定的促進(jìn)作用。植物原料經(jīng)過(guò)脈沖疝氣燈管閃照后其細(xì)胞受損［10］，提高酶的活性。糙米的發(fā)芽實(shí)質(zhì)是一個(gè)酶解的過(guò)程，糙米在發(fā)芽過(guò)程中，內(nèi)源的谷氨酸脫羧酶(Glutamate decarboxylase，GAD)被激活，將糙米中的谷氨酸轉(zhuǎn)化為GABA，從而顯著地提高GABA的含量，而GAD活性又受谷氨酸濃度等因素的影響［11］;植物受到低氧、缺氧、冷激、熱激、鹽脅迫以及機(jī)械刺激等逆境脅迫時(shí)，植物體內(nèi)GABA含量明顯升高，機(jī)械刺激引起GABA積累的可能途徑是植物細(xì)胞內(nèi)H+濃度的增加，進(jìn)而激發(fā)GAD活性，導(dǎo)致GABA的積累;鹽脅迫逆境處理引起GABA積累的途徑是Ca2+濃度的提高，進(jìn)而促進(jìn)內(nèi)源酶谷氨酸脫羧酶的活性的提高［12］。對(duì)發(fā)芽糙米進(jìn)行適宜的脈沖強(qiáng)光處理能夠促進(jìn)GABA積累［13-14］。這種現(xiàn)象與植物受到低氧、缺氧、冷激、熱激、鹽脅迫以及機(jī)械刺激等逆境脅迫時(shí)，植物體內(nèi)GABA成倍增加非常相似。因此，本實(shí)驗(yàn)對(duì)鹽脅迫下的發(fā)芽糙米進(jìn)行脈沖強(qiáng)光處理，研究發(fā)芽糙米積累GABA的變化規(guī)律，為生產(chǎn)高含量GABA的健康食品原料及開(kāi)辟脈沖強(qiáng)光應(yīng)用新領(lǐng)域奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

糙米 鞍山市熙祥食品有限公司;γ-氨基丁酸(GABA)標(biāo)品(純度＞99%)Sigma公司;谷氨酸鈉(味精，谷氨酸鈉＞99% 無(wú)鹽)北京市朝陽(yáng)區(qū)中聯(lián)化工試劑廠(chǎng);甲醇，色譜純 Merck KGaA Darmstadt Germany;鄰苯二甲醛(OPA，化學(xué)純)國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;β-巰基乙醇(純度＞99%) 天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司;次氯酸鈉，分析純，有效氯為9%天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司;硼酸，分析純 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;無(wú)水乙醇，分析純 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;乙酸鈉，分析純 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

ZWB-I-01(LA50-800H)脈沖強(qiáng)光表面殺菌實(shí)驗(yàn)柜 寧波中物光電殺菌技術(shù)有限公司;Agilent-1200高效液相色譜儀 美國(guó)Agilent公司;HH-601A超級(jí)恒溫水浴鍋 江蘇省金壇市醫(yī)療儀器廠(chǎng);HPX-9082ME型電熱恒溫培養(yǎng)箱 上海一恒科學(xué)儀器有限公司;DHG-9055A電熱鼓風(fēng)干燥箱 上海一恒科學(xué)儀器有限公司;RRH-A500型高速多功能粉碎機(jī) 上海緣沃工貿(mào)有限公司;SHB-Ⅲ循環(huán)水式多用真空泵 鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司;SK6210HP超聲波清洗器 上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司;0．45μm微孔濾膜(有機(jī)系) 上海興亞凈化材料廠(chǎng);SC-279GA海爾冰柜 海爾公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1．2．1 發(fā)芽糙米的制備 精選顆粒飽滿(mǎn)、胚芽保留完整的為原料，先用蒸餾水清洗3遍，然后用1%的次氯酸鈉溶液浸泡5min(加入量以剛好淹沒(méi)糙米為宜)，消毒之后用清水清洗3遍，蒸餾水清洗3遍，于30℃水浴鍋中浸泡12h，28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)發(fā)芽，發(fā)芽結(jié)束后將培養(yǎng)皿放入55℃烘箱終止活性［15］，干燥至5h，于4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1．2．2 脈沖強(qiáng)光處理 打開(kāi)脈沖強(qiáng)光實(shí)驗(yàn)柜，運(yùn)行10min后儀器保持穩(wěn)定啟動(dòng)，根據(jù)蔣靜等［14］研究設(shè)置實(shí)驗(yàn)脈沖參數(shù)，脈沖強(qiáng)光能量300J，脈沖距離11cm，脈沖頻次為1次/s，將浸泡好的糙米放在培養(yǎng)皿中，每份8g，然后將培養(yǎng)皿放在無(wú)菌的石英板的中央，關(guān)上柜門(mén)，開(kāi)始不同實(shí)驗(yàn)參數(shù)的脈沖強(qiáng)光處理，每隔5min處理一次。

1．2．3 發(fā)芽糙米GABA提取 將發(fā)芽糙米樣品干燥粉碎，過(guò)60目篩，于雙層密封袋4℃保存，準(zhǔn)確稱(chēng)取2．5g發(fā)芽糙米樣品，加適量蒸餾水研磨勻漿，然后定容至25mL于70℃水浴鍋中浸提2h，水浴后3000r/min離心分離，然后取上清液待測(cè)［16］。

1．2．4 GABA 含量的測(cè)定

1．2．4．1 HPLC 色譜條件 色譜柱:AgilentTC-C18色譜柱(4．6mm × 250mm，5μm)，柱溫 35℃，流動(dòng)相:0．05mol/L CH3COONa·3H2O(pH6．8)，500mL;甲醇300mL;進(jìn)樣量10μL，流速 1mL/min，單泵，紫外檢測(cè)波長(zhǎng)248nm。

1．2．4．2 衍生試劑的配制 準(zhǔn)確稱(chēng)取10mg鄰苯二甲醛(OPA)，與10mL甲醇溶液充分溶解后轉(zhuǎn)移至50mL棕色容量瓶中，然后加0．05mL β-巰基乙醇和2mL，pH9．5的硼酸緩沖液，最后用超純水定容至50mL，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1．2．4．3 樣品GABA的檢測(cè) 將發(fā)芽糙米樣品干燥粉碎，過(guò)60目篩，于雙層密封袋4℃保存，準(zhǔn)確稱(chēng)取2．5g發(fā)芽糙米樣品，與60℃水浴中浸提2h，水浴后4000r/min離心20min，取上清液0．5mL，加 OPA 衍生試劑0．5mL進(jìn)行柱前衍生3min，之后立即過(guò)膜，進(jìn)樣檢測(cè)［17］。

1．2．4．4 GABA標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制 準(zhǔn)確稱(chēng)取 GABA標(biāo)準(zhǔn)品500mg，用超純水溶解并定容于50mL的容量瓶中，振蕩搖勻，配制成10mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，然后再用上述標(biāo)準(zhǔn)溶液分別稀釋至 0．05、0．1、0．15、0．2、0．25mg/mL系列濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，以O(shè)PA為柱前衍生試劑衍生3min后進(jìn)樣檢測(cè)，以相應(yīng)質(zhì)量濃度標(biāo)準(zhǔn)液為橫坐標(biāo)(mg/mL)，以γ-氨基丁酸色譜峰面積為縱坐標(biāo)(mAU)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。

1．2．5 單因素實(shí)驗(yàn)方法 本實(shí)驗(yàn)過(guò)程中研究谷氨酸鈉濃度、脈沖時(shí)間和發(fā)芽時(shí)間三個(gè)因素對(duì)發(fā)芽糙米GABA含量的影響，每次實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1．2．5．1 谷氨酸鈉濃度單因素實(shí)驗(yàn) 取6份糙米，每份 10g，分別用 80mL，濃度為 0、1．0、1．5、2．0、2．5、3．0(mg/mL)的谷氨酸鈉溶液于30℃恒溫水浴鍋內(nèi)浸泡12h，然后放入培養(yǎng)箱內(nèi)發(fā)芽，滅酶干燥得到發(fā)芽糙米，測(cè)定其GABA含量，重復(fù)3次。

1．2．5．2 脈沖時(shí)間單因素實(shí)驗(yàn) 糙米浸泡后，將糙米鋪在墊有濾紙的培養(yǎng)皿中，在脈沖單次能量為300J、脈沖距離為11cm、脈沖頻次1次/s的條件下分別照射 10、20、30、40、50s，然后放入培養(yǎng)箱內(nèi)發(fā)芽，滅酶干燥得到發(fā)芽糙米，以無(wú)脈沖強(qiáng)光處理為對(duì)照組，測(cè)定其GABA含量，重復(fù)3次。

1．2．5．3 發(fā)芽時(shí)間單因素實(shí)驗(yàn) 糙米浸泡后，進(jìn)行脈沖處理，然后放入培養(yǎng)箱內(nèi)分別發(fā)芽16、20、24、28、32、36h，滅酶干燥得到發(fā)芽糙米，以無(wú)發(fā)芽處理為對(duì)照組，測(cè)定其GABA含量，重復(fù)3次。

1．2．6 實(shí)驗(yàn)條件優(yōu)化 根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，以谷氨酸鈉濃度、脈沖處理時(shí)間以及發(fā)芽時(shí)間為單因素，發(fā)芽糙米中GABA積累含量為響應(yīng)值設(shè)計(jì)響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)，優(yōu)化糙米發(fā)芽工藝，根據(jù)Box-Behnken的中心組合設(shè)計(jì)原理［18］，通過(guò) Design-Expert8．0 軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，各因素及水平編碼如表1所示。

表1 Box-Behnken實(shí)驗(yàn)因素及水平Table 1 Experiment factors and their levels for Box-Behnken design

1.3 最佳發(fā)芽條件的驗(yàn)證

根據(jù)實(shí)驗(yàn)的優(yōu)化結(jié)果，運(yùn)用Design-Expert8．0得出回歸方程，以積累發(fā)芽糙米GABA最優(yōu)含量為響應(yīng)值，得出發(fā)芽糙米GABA工藝參數(shù)和理論含量，將得出的工藝參數(shù)修正以便于操作后，進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，用來(lái)評(píng)價(jià)工藝參數(shù)的可靠性。

1.4 數(shù)據(jù)分析

運(yùn)用 Design-Expert軟件(Version 8．0．6)對(duì)響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行線(xiàn)性回歸和方差分析，模型和因素的顯著性以F值進(jìn)行考察(p＜0．05)，所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次，以干基表示結(jié)果。

2 結(jié)果與討論

2.1 GABA高效液相色譜檢測(cè)圖

利用柱前衍生高效液相色譜法測(cè)定GABA標(biāo)準(zhǔn)品和發(fā)芽糙米樣品的譜圖如圖1和圖2所示，在1．2．4．1色譜條件下，在 AgilentTC-C18色譜柱上對(duì)衍生的標(biāo)樣和實(shí)際發(fā)芽糙米樣品組分進(jìn)行了有效的分離，標(biāo)準(zhǔn)品中γ-氨基丁酸的保留時(shí)間為5．846min，發(fā)芽糙米樣品中γ-氨基丁酸的保留時(shí)間為5．976min，實(shí)際發(fā)芽糙米樣品中其他共存氨基酸和雜質(zhì)不干擾目標(biāo)物的測(cè)定，GABA與其他氨基酸衍生物分離比較完全，其他雜質(zhì)對(duì)測(cè)定基本沒(méi)有干擾。

圖1 GABA標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖Fig．1 Chromatogram ofγ-aminobutyric acid standard

2.2 GABA標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)

得到的GABA標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的回歸方程為y=54744x+8070．3，R2=0．9988。

2.3 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2．3．1 鹽濃度對(duì)發(fā)芽糙米GABA含量的影響 由圖4可知，隨著谷氨酸鈉濃度的增加，GABA含量先呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，當(dāng)谷氨酸鈉濃度達(dá)到2．0mg/mL時(shí)，GABA含量達(dá)到最高，之后呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，原因可能是隨著谷氨酸鈉濃度的增加，谷氨酸脫羧酶可利用的底物逐漸增多，過(guò)高濃度的谷氨酸鈉溶液會(huì)抑制GABA 的生成［19］。

圖2 發(fā)芽糙米色譜圖Fig．2 Chromatogram of the germinated brown rice powder sample

圖3 γ-氨基丁酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)Fig．3 Standard curve of γ-aminobutyric acid

圖4 谷氨酸鈉濃度對(duì)GABA含量的影響Fig．4 Effect of Sodium glutamate concentrationon the GABA content

2．3．2 脈沖時(shí)間對(duì)發(fā)芽糙米GABA含量的影響 由圖5可知，當(dāng)脈沖閃照時(shí)間為30s時(shí)，發(fā)芽糙米GABA含量達(dá)到最大，之后隨著脈沖閃照時(shí)間的延長(zhǎng)，GABA含量呈下降趨勢(shì)，原因可能是隨著脈沖閃照時(shí)間的延長(zhǎng)，酶活性下降，加速了酶蛋白的分解，進(jìn)而影響糙米的發(fā)芽。當(dāng)脈沖處理達(dá)到30s時(shí)，脈沖能量改變了蛋白酶和谷氨酸脫羧酶的活性，蛋白酶水解儲(chǔ)存性蛋白質(zhì)，成為水溶性的氨基酸GABA。

2．3．3 發(fā)芽時(shí)間對(duì)發(fā)芽糙米GABA含量的影響 由圖6可知，在糙米發(fā)芽的過(guò)程中，隨著發(fā)芽時(shí)間的延長(zhǎng)，GABA含量呈現(xiàn)先增長(zhǎng)后下降的趨勢(shì)，發(fā)芽到28h含量達(dá)到最大值，隨著發(fā)芽培養(yǎng)時(shí)間的繼續(xù)延長(zhǎng)，GABA含量逐漸降低，原因可能是在較長(zhǎng)時(shí)間的發(fā)芽過(guò)程中，GABA在轉(zhuǎn)氨酶的作用下，轉(zhuǎn)換成琥珀酸半醛，使得 GABA含量開(kāi)始下降［20］，本實(shí)驗(yàn)條件下，發(fā)芽時(shí)間為28h較為適宜。

圖5 脈沖時(shí)間對(duì)GABA含量的影響Fig．5 Effect of Pulsed light flash time on the GABA content

圖6 發(fā)芽時(shí)間對(duì)GABA含量的影響Fig．6 Effect of germination time on the GABA content

2.4 響應(yīng)面分析法優(yōu)化糙米發(fā)芽條件結(jié)果分析

2．4．1 實(shí)驗(yàn)因素水平編碼與實(shí)驗(yàn)結(jié)果 采用RSM軟件進(jìn)行Box-Behnken中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，依次進(jìn)行浸泡培養(yǎng)發(fā)芽，以發(fā)芽糙米中GABA含量為響應(yīng)值(Y)進(jìn)行響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果如表2所示。

表2 Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Test design and results of Box-Behnken design

2．4．2 二次多項(xiàng)式回歸模型建立與顯著性檢驗(yàn) 由于各因素對(duì)發(fā)芽糙米積累GABA影響不是簡(jiǎn)單的線(xiàn)性關(guān)系，為了更好說(shuō)明各因素對(duì)響應(yīng)值的影響，根據(jù)回歸方程繪制響應(yīng)面分析圖［15］，采用Design-Expert 8．0軟件對(duì)二次回歸模型進(jìn)行分析，擬合后得到關(guān)于谷氨酸鈉濃度(A)、脈沖時(shí)間(B)、發(fā)芽時(shí)間(C)二次多項(xiàng)回歸方程:

Y=180．82+2．38A+6．23B-2．05C-7．83AB+9．68AC+8．43BC-25．32A2-16．17B2-5．32C2

由表3可知，整體模型極為顯著(“Pr＞F”值＜0．0001)，失擬項(xiàng)不顯著(p ＞0．05)，說(shuō)明該模型在統(tǒng)計(jì)學(xué)上有意義并對(duì)實(shí)驗(yàn)擬合較好，說(shuō)明該模型能夠解釋99．14%響應(yīng)值的變化，同時(shí)說(shuō)明了GABA含量隨著發(fā)芽條件的變化，因素B(脈沖時(shí)間)對(duì)響應(yīng)值影響極顯著(p＜0．0001)，且交互項(xiàng)AB(p＜0．0001)、AC(p ＜ 0．05)、BC(p ＜ 0．05)的交互作用對(duì)發(fā)芽糙米富集GABA影響顯著，綜上所知，各個(gè)因素對(duì)響應(yīng)值的影響程度為:B(脈沖時(shí)間)＞A(谷氨酸鈉濃度)＞C(發(fā)芽時(shí)間)。

表3 回歸方程的統(tǒng)計(jì)分析Table 3 Statistical analysis of regression equation

2．4．3 響應(yīng)面水平的優(yōu)化 回歸方程中影響顯著的交互項(xiàng)所做的響應(yīng)面曲線(xiàn)圖如圖7～圖9所示。根據(jù)回歸方程繪制響應(yīng)面分析圖，運(yùn)用Design-Expert 8．0軟件對(duì)模型進(jìn)行分析，尋求發(fā)芽糙米積累GABA最大值的穩(wěn)定點(diǎn)及對(duì)應(yīng)的因素水平，由圖7～圖9最高穩(wěn)定點(diǎn)和等高線(xiàn)面圖可知，回歸模型存在穩(wěn)定點(diǎn)，穩(wěn)定點(diǎn)即極大值點(diǎn)，結(jié)合二次多項(xiàng)式的回歸方程進(jìn)行模型的統(tǒng)計(jì)分析，對(duì)回歸模型求一階偏導(dǎo)，得出各個(gè)因素的最佳條件參數(shù)是 A=2．01，B=31．80，C=27．84，即谷氨酸鈉濃度為 2．01mg/mL，脈沖時(shí)間為31．80s，發(fā)芽時(shí)間為 27．84h，在此參數(shù)條件下，發(fā)芽糙米中GABA含量達(dá)182．6mg/100g。

圖7 Y=f(A，B)響應(yīng)面圖Fig．7 Response surface of the effects of A and B on the content of γ-aminobutyric acid

圖8 Y=f(A，C)響應(yīng)面圖Fig．8 Response surface of the effects of A and C on the content of γ-aminobutyric acid

2.5 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

對(duì)最佳工藝條件進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，重復(fù)實(shí)驗(yàn)5次，得到脈沖強(qiáng)光處理鹽脅迫下發(fā)芽糙米GABA含量實(shí)測(cè)值為181．5mg/100g，與理論值接近，說(shuō)明通過(guò)響應(yīng)面優(yōu)化后得出的工藝參數(shù)具有一定得實(shí)踐指導(dǎo)意義，因此，可用此模型預(yù)測(cè)并指導(dǎo)生產(chǎn)實(shí)際。

3 結(jié)論

圖9 Y=f(B，C)響應(yīng)面圖Fig．9 Response surface of the effects of B and C on the content of γ-aminobutyric acid

根據(jù)單因素以及Box-Behnken響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)，建立發(fā)芽糙米積累GABA影響因素的二次回歸模型，該模型回歸顯著，實(shí)驗(yàn)擬合誤差小，具有一定的實(shí)際指導(dǎo)價(jià)值，并得到脈沖強(qiáng)光對(duì)鹽脅迫下發(fā)芽糙米積累GABA最佳工藝條件:谷氨酸鈉濃度2．01mg/mL，脈沖時(shí)間 31．80s及發(fā)芽時(shí)間 27．84h，驗(yàn)證值與預(yù)測(cè)值接近，因此說(shuō)明響應(yīng)面法優(yōu)化鹽脅迫下對(duì)發(fā)芽糙米實(shí)施脈沖強(qiáng)光處理積累GABA參數(shù)的可行性，可為今后實(shí)際生產(chǎn)和評(píng)價(jià)發(fā)芽糙米富集GABA含量提供理論依據(jù)。

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