白騰輝，潘潤淑，馬亞萍，項豐娟，馬漢軍

(河南科技學(xué)院食品學(xué)院，河南新鄉(xiāng)453003)

酪蛋白在牛奶中約占80%，是一種重要的乳源全蛋白，具有較高的營養(yǎng)價值［1］，其在食品、保健品等領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用前景。酪蛋白中蘊涵著多種生物活性肽，這些活性肽具有抗菌、降血壓、抗凝血、調(diào)節(jié)免疫、結(jié)合礦物質(zhì)(Ca2+、Fe2+、Zn2+)、抗氧化和促進雙歧桿菌增殖等的功能特性［2］，但由于酪蛋白在胃中易形成較大堅硬結(jié)塊，蘊藏其中的生物活性多肽并無活性。研究表明，酶法水解是蛋白質(zhì)改性，有效改善其物理、化學(xué)性質(zhì)，提高其適口性、貯存與營養(yǎng)特性的最有效途徑之一［3-4］，使得蛋白水解后產(chǎn)生的肽段更易于機體的吸收、轉(zhuǎn)運及利用［5］。且因其作用過程溫和，易于控制，專一性強，效率高，且不破壞氨基酸結(jié)構(gòu)等，已成為當(dāng)今國際蛋白質(zhì)加工領(lǐng)域最有前途的發(fā)展方向之一［6］。

目前，在蛋白質(zhì)酶法水解制備生物活性肽領(lǐng)域研究較多的是采用單一性酶，缺乏對比性。有鑒于此，本實驗選用五種酶對酪蛋白進行水解，從中篩選出酪蛋白水解的最佳用酶;之后再通過單因素和響應(yīng)曲面實驗對該酶酶解過程的主要影響因子進行優(yōu)化，確定酪蛋白酶法水解的最佳條件。以期為改善酪蛋白水解物生物活性，為制備、開發(fā)生物活性肽及其產(chǎn)品提供更具說服力的指導(dǎo)，同時也為進一步探索酪蛋白酶解機理打下基礎(chǔ)。因此，酪蛋白的酶解處理對擴大其應(yīng)用范圍及新型乳源蛋白制品的開發(fā)有著重要的促進作用。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

胰蛋白酶 aladdin(上海晶純生化科技股份有限公司)，酶活力1∶250;胃蛋白酶 aladdin，酶活力1∶15000;木瓜蛋白酶 aladdin，酶活力≥3u/mg;堿性蛋白酶 Solarbio(北京索萊寶科技有限公司)，酶活力≥200u/mg;中性蛋白酶 Solarbio，酶活力≥60u/mg;酪蛋白 Solarbio，含量≥85%;甲醛，鹽酸，氫氧化鈉，磷酸鹽等 所用其他化學(xué)試劑均為分析純。

FA224型電子天平 上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司;79-1磁力加熱攪拌器 江蘇正基儀器有限公司;SHA-C數(shù)顯水浴恒溫振蕩器 江蘇省金壇市華峰儀器有限公司;電子萬用爐 北京光明醫(yī)療儀器廠;PHS-3C型精密pH計 上海雷磁儀器廠;KjeltecTM8400全自動凱氏定氮儀 FOSS Denmark。

表2 各酶粗略水解條件及結(jié)果Table 2 The rough hydrolysis conditions and results of each enzyme

1.2 實驗方法

1．2．1 酪蛋白水解工藝流程 在50mL蒸餾水中加入酪蛋白(10mg/mL)→磁力攪拌器上充分?jǐn)嚢枋蛊淙芙狻{(diào)溶液pH→加定量酶→恒溫振蕩器內(nèi)水解→100℃水浴滅酶10min→冷卻至室溫→指標(biāo)測定。

1．2．2 水解酶的選擇 根據(jù)文獻［7］，初步確定各酶粗略的最適水解條件，按照1．2．1的水解步驟進行水解，通過水解度、水解風(fēng)味及水解液外觀來確定水解酪蛋白的較優(yōu)酶。

1．2．3 單因素實驗 取上述較優(yōu)酶水解酪蛋白，以水解度為測定指標(biāo)，測定不同 pH(1．0、1．5、2．0、2．5、3．0)、溫度(40、45、50、55、60℃)、加酶量(0．5、1．0、1．5、2．0、2．5 mg/mL)及酶解時間(2、4、6、8、10 h)對酶解效率的影響，初步確定該酶的適宜酶解范圍。

1．2．4 酶解工藝條件的響應(yīng)曲面實驗設(shè)計 在單因素實驗的基礎(chǔ)上，根據(jù)Box-Behnken設(shè)計原理，以酪蛋白酶解過程中的水解度為響應(yīng)值，選取pH、溫度及加酶量為影響因子，進行3因素3水平響應(yīng)面實驗，確定酪蛋白酶解的最佳工藝參數(shù)。實驗因素水平表見表1。

表1 響應(yīng)面實驗因素水平編碼表Table 1 Factors and levels of response surface experiment

1．2．5 水解度的測定 甲醛滴定法測水解度［8-9］，取蛋白酶解液5mL置于100mL容量瓶中，定容、混勻后取20mL置于200mL燒杯中，加入60mL去CO2水，用0．05mol/L標(biāo)準(zhǔn) NaOH 溶液滴定至 pH8．2。加入10mL甲醛溶液，混勻后再用0．05mol/L標(biāo)準(zhǔn) NaOH溶液繼續(xù)滴定至pH9．2，同時用蒸餾水代替酶解液做空白對照。記錄所消耗的標(biāo)準(zhǔn)NaOH溶液的體積，計算水解度(DH)。

式中:c為標(biāo)準(zhǔn)NaOH溶液濃度，mol/L;V1為樣品消耗氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液的體積，mL;V2為試劑空白消耗氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液的體積，mL;V3為試劑稀釋液取用量，為1mL(5mL酶解液定容100mL后取用20mL);S為底物濃度(mg/mL);W為樣品中蛋白質(zhì)含量，本實驗所用酪蛋白樣品中蛋白質(zhì)含量用全自動凱氏定氮儀，微量凱氏定氮法［10］測定，為87．34%;htot為蛋白質(zhì)中肽鍵總數(shù) mmol/g，酪蛋白中肽鍵總數(shù)為8．2×10-3mmol/g。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有實驗數(shù)據(jù)均重復(fù)三次，采用Spass 14．0和Design Expert 7．0對各實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 酪蛋白水解酶的確定

不同的酶切方式對酪蛋白酶解液的乳化性、疏水性等指標(biāo)均有不同程度的影響，從而呈現(xiàn)出不同的水解程度和感官品質(zhì)［11］。分別采用胰蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、堿性蛋白酶及中性蛋白酶在各自最適條件下水解定量酪蛋白，其較適宜水解條件及水解結(jié)果見表2。

從表2中可以看出，5種酶對酪蛋白的水解效果各有所不同。采用中性蛋白酶水解酪蛋白時的水解度最高，但其水解液有明顯的苦味、異味，且有些許的渾濁現(xiàn)象，不易于后期處理;木瓜蛋白酶水解后獲得的水解液有較好的感官，但水解度較低;而胰蛋白酶、胃蛋白酶、堿性蛋白酶的水解液的風(fēng)味、外觀變化不大，但胃蛋白酶在水解酪蛋白時有較高的水解度。綜合考慮上述實驗結(jié)果，篩選出胃蛋白酶為水解酪蛋白的最佳用酶。

2.2 胃蛋白酶水解酪蛋白的單因素實驗

水解度是檢測和控制酪蛋白水解程度的重要指標(biāo)，所得水解物的營養(yǎng)價值和功能特性以及水解過程生成的苦味肽的多少均與之有關(guān)［12］。根據(jù)2．1確定的胃蛋白酶粗略的適宜水解條件進行酶解單因素實驗，以水解度(DH)為測定指標(biāo)，確定各個因素較佳的酶解反應(yīng)范圍。

由圖1可知，在pH1．5左右，胃蛋白酶對酪蛋白的水解程度顯示出最大值，超過此pH時，胃蛋白酶的活性明顯降低，酪蛋白水解度迅速下降。該酶適宜的水解溫度為 55℃左右，最佳酶用量為 1．5～2．5mg/mL，較好的酶解時間為6h以上。

2.3 胃蛋白酶水解酪蛋白的響應(yīng)面優(yōu)化實驗

圖1 不同pH(a)、溫度(b)、酶量(c)、酶解時間(d)對酶解產(chǎn)物DH的影響Fig．1 The effects of different pH(a)，temperature(b)，enzyme concentration(c)and time(d)on hydrolysates’degree of hydrolysis

根據(jù)2．2的單因素實驗結(jié)果，從中選出對實驗影響較大的三個因子(pH、溫度、酶量)，按表1進行3因素3水平的Box-Behnken的實驗設(shè)計，實驗設(shè)計及結(jié)果見表3。

采用Statistica8．0分析軟件對表3的結(jié)果進行回歸分析，方差分析結(jié)果見表4。

由表4可以看出，模型的p值＜0．0001，說明回歸模型極顯著。失擬項p=0．055＞0．05不顯著，說明該模型有較好的擬合度。根據(jù)回歸系數(shù)，可得酪蛋白水解度的二次多項回歸方程為:DH=9．88250X1+2．79975X2+0．26X3-0．018X1X2+0．11X1X3+1E-003X2X3-3．02X12-0．0256X22-0．15X32-74．39?；貧w系數(shù)的顯著性分析結(jié)果表明為極顯著項，X1、X2項顯著，其他項均不顯著，說明pH及溫度對水解度的影響較大。由方差分析結(jié)果可知，研究范圍內(nèi)的3個因素對水解度影響的大小順序為:X1＞X2＞X3，即pH＞溫度＞加酶量。

表3 響應(yīng)面分析實驗設(shè)計及結(jié)果Table 3 Results of response surface experiments

通過響應(yīng)面的數(shù)字最優(yōu)組合分析得到酪蛋白的最佳酶解條件為:pH1．31、加酶量 1．75mg/mL、溫度57．37℃，最優(yōu)條件下水解度為 9．45% 。

2．3．1 pH和溫度之間的交互作用的分析與優(yōu)化 圖2為pH與溫度之間的交互作用，加酶量2mg/mL，酶解時間6h，當(dāng)溫度一定時，隨著pH的升高，酪蛋白的水解度迅速上升后又下降;當(dāng)pH不變時，水解度也呈現(xiàn)出迅速上升后又下降的趨勢。表明pH、溫度過高過低都不利于酪蛋白的水解。等高線圖呈橢圓形，說明pH與溫度的交互作用顯著。等高線沿溫度方向的軸向比pH軸向密集，說明溫度對酪蛋白水解程度的影響比pH的影響大。

圖2 pH和溫度對酪蛋白水解度影響的響應(yīng)面圖Fig．2 Response surface graph of pH and temperature on the degree of casein hydrolysis

2．3．2 pH和加酶量之間的交互作用的分析與優(yōu)化 從圖3可以看出，加酶量不變時，隨著pH的升高，酪蛋白的水解度先上升后又下降，升高和下降的幅度都很明顯;當(dāng)pH處于較高或較低水平時，酶量的增加對水解度的影響不大，當(dāng)pH處于中等水平時，隨著加酶量的增大，酪蛋白水解度平穩(wěn)升高后穩(wěn)定。加酶量與pH的交互作用顯著。pH曲線較陡，加酶量的曲線相對平緩軸向密集，說明pH對酪蛋白水解程度的影響比加酶量的影響大。

表4 二次響應(yīng)面回歸模型方差分析表Table 4 Analysis of variance for the fitted quadratic response surface regression model

圖3 pH和加酶量對酪蛋白水解度影響的響應(yīng)面圖Fig．3 Response surface graph of pH andenzyme concentration on the degree of casein hydrolysis

2．3．3 溫度和加酶量之間的交互作用的分析與優(yōu)化 圖4為加酶量和溫度之間的交互作用，pH1．5，酶解時間6h。當(dāng)溫度一定時，隨著酶量的升高，酪蛋白的水解度平緩上升后穩(wěn)定;當(dāng)加酶量不變時，水解度隨溫度的升高呈現(xiàn)出上升后又迅速下降的趨勢。橢圓形等高線圖說明加酶量與溫度間的交互作用顯著。等高線沿溫度方向的軸向比加酶量軸向密集，說明溫度對酪蛋白水解程度的影響比加酶量的影響大。

2．3．4 酶解最佳工藝條件的確定及驗證結(jié)果 為驗證響應(yīng)面所得結(jié)果的可靠性，采用由Design Expert軟件得到的胃蛋白酶酶解酪蛋白的最佳工藝條件(pH1．31、加酶量1．75mg/mL、溫度57．37℃)對其進行驗證，考慮到實驗的實際可操作性，將工藝參數(shù)中的pH修正為1．3，水解溫度修正為57℃。在此條件下水解6h，三次平行實驗所得的酪蛋白平均水解度為9．18%，與預(yù)測值9．45%基本相符。說明采用此方法優(yōu)化得到的酪蛋白水解條件與實際擬合較好，具有實用價值。

圖4 溫度和加酶量對酪蛋白水解度影響的響應(yīng)面圖Fig．4 Response surface graph of temperature and enzyme concentration on the degree of casein hydrolysis

3 結(jié)論

通過比較不同蛋白酶對酪蛋白水解效果的影響，選定胃蛋白酶為酪蛋白水解的最佳用酶。在單因素實驗的基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面法對該酶酶解過程中的主要影響因子進行優(yōu)化，建立了較合理有效的水解度與pH、溫度、加酶量的數(shù)學(xué)模型，該模型能較好的預(yù)測胃蛋白酶酶解酪蛋白的水解程度。

應(yīng)用響應(yīng)面法優(yōu)化得到的酪蛋白酶法水解的最佳條件為:pH1．3、加酶量 1．75mg/mL、溫度 57℃，此時水解度為9．18%，與模型驗證的水解度9．45%非常接近。說明響應(yīng)面法能較好的用于酪蛋白酶解工藝的優(yōu)化，可為酪蛋白酶解的進一步研究及生物活性肽類產(chǎn)品的開發(fā)提供理論依據(jù)。

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