馮大偉 , 姜 鵬, 李富超, 秦 松 趙 瑾, 陳華新

(1.海岸帶生物學(xué)與生物資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 中國(guó)科學(xué)院 煙臺(tái)海岸帶研究所 山東煙臺(tái) 264003; 2.實(shí)驗(yàn)海洋生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 中國(guó)科學(xué)院 海洋研究所 山東青島 266071)

滸苔屬大型綠藻, 在我國(guó)南、北方海區(qū)均有分布[1]。滸苔兼具有性、無(wú)性及營(yíng)養(yǎng)繁殖等多種繁殖方式[2],日生長(zhǎng)率可達(dá)12.7%[3], 有些種類還可漂浮生長(zhǎng)并大量聚集, 短期內(nèi)形成可觀的生物量[4-5], 是一種亟待開(kāi)發(fā)的資源生物。盡管滸苔可作為食品、飼料、肥料和藥物開(kāi)發(fā)的原料[6], 但應(yīng)用仍非常有限, 缺乏大規(guī)模資源化利用的新途徑。

目前, 生物質(zhì)產(chǎn)燃料乙醇研究主要是以農(nóng)業(yè)廢棄物為原料, 如玉米芯[7]、甘蔗渣、小麥與稻米秸稈和木屑等[8]。以大型海藻作為生物質(zhì)產(chǎn)燃料乙醇的嘗試仍非常有限, 僅見(jiàn)Horn等[9]以北方海帶Laminaria hyperborea的提取物——褐藻淀粉和甘露醇為原料進(jìn)行乙醇發(fā)酵, 每克提取物最高可產(chǎn)生0.43 g乙醇,其褐藻淀粉與甘露醇的提取工藝和酒精發(fā)酵工藝仍有待進(jìn)一步優(yōu)化。由于滸苔藻體柔軟, 由單層細(xì)胞構(gòu)成, 較陸地生物質(zhì)更易于被酸、堿和酶消化, 且滸苔生物量可觀, 干基含有 50%以上的多糖和 10%左右的纖維素[10-12], 具有發(fā)酵產(chǎn)燃料乙醇的潛力, 作為能源生物開(kāi)發(fā)將為滸苔的資源利用開(kāi)辟新途徑。

生物質(zhì)糖化是產(chǎn)燃料乙醇的關(guān)鍵工藝, 常見(jiàn)的生物質(zhì)糖化方法有酸法、酶法, 以及先用酸預(yù)處理,再用酶解生物質(zhì)等方法[13-17]。本文對(duì)利用滸苔進(jìn)行稀硫酸水解及纖維素酶酶解進(jìn)行了比較研究, 確定了本文實(shí)驗(yàn)條件下滸苔糖化的最佳工藝, 為進(jìn)一步的燃料乙醇發(fā)酵研究提供了參考。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

2008年6 月自青島第一海水浴場(chǎng)采集岸邊擱淺堆積的新鮮漂浮滸苔。

1.2 測(cè)定滸苔總糖含量

使用改進(jìn)的硫酸兩步水解法測(cè)定滸苔總糖含量[18]。將新鮮滸苔清洗除去鹽分、泥沙和雜藻, 于105℃恒溫干燥 4 h至恒重, 為了使?jié)G苔能被硫酸充分水解,用液氮充分研磨成細(xì)微粉末, 然后再次105℃恒溫干燥4 h至恒重, 稱取上述滸苔樣品200 mg轉(zhuǎn)入試管,加入2 mL 72%的硫酸, 30℃水解60 min, 之后將水解液完全轉(zhuǎn)移至可密封的聚四氟乙烯罐中, 并加入51.1 mL蒸餾水將硫酸濃度稀釋至4%, 高壓滅菌鍋中121℃反應(yīng)60 min, 水解液8 000 r/min離心5 min,上清液用 3, 5-二硝基水楊酸(DNS)比色法測(cè)定還原糖含量(測(cè)3個(gè)平行樣品)[19], 滸苔總糖含量計(jì)算公式如下:

式中,ES——滸苔總糖含量;C——滸苔水解液還原糖濃度;m——反應(yīng)體系中滸苔質(zhì)量; 53.1——水解液總體積; 0.9——換算系數(shù)[16]。

1.3 滸苔稀硫酸水解工藝

將新鮮滸苔清洗除去鹽分、泥沙和雜藻, 加入適量蒸餾水后用高速組織粉碎機(jī)徹底打碎, 過(guò)濾擠壓除去水分, 4℃冷藏備用。稱取適量新鮮滸苔(干質(zhì)量1.0 g)置于50 mL的聚四氟乙烯消化罐中, 加19 mL蒸餾水使?jié)G苔干物質(zhì)含量為 5%, 再加入濃硫酸, 設(shè)置硫酸梯度終濃度分別為0.6%、1.0%、1.4%、1.8%、2.2%, 消化罐加蓋密封后于高壓滅菌鍋中 121℃分別處理30、60、90 min, 將反應(yīng)液過(guò)濾、8 000 r/min離心5 min, DNS比色法測(cè)定上清液中還原糖含量(測(cè)兩個(gè)平行樣品), 滸苔固體殘留物用蒸餾水沖洗至pH中性(用pH試紙測(cè)量pH為7.0)并分別收集。

1.4 纖維素酶水解

將每個(gè)沖洗至 pH中性(用 pH試紙測(cè)量 pH為7.0)的滸苔稀硫酸水解殘留物樣品分別與30 mL檸檬酸鈉緩沖液(pH = 4.6)混合于 150 mL三角瓶中,加入5 mg纖維素酶(酶活力>30 000 U/g), 恒溫?fù)u床中 45℃酶解 48 h, 搖床轉(zhuǎn)速為 120 r/min, 酶解后8 000 r/min離心5min, 上清液用DNS比色法測(cè)定還原糖含量。

2 結(jié)果

DNS比色法測(cè)定滸苔總糖含量為 67.2%。滸苔經(jīng)不同濃度稀硫酸水解不同反應(yīng)時(shí)間后的還原糖產(chǎn)量(mg/g, 干滸苔)、滸苔稀硫酸水解殘留物經(jīng)酶解后還原糖產(chǎn)量以及二者數(shù)值相加的還原糖總產(chǎn)量見(jiàn)表1。滸苔經(jīng)不同濃度稀硫酸水解不同反應(yīng)時(shí)間的還原糖轉(zhuǎn)化率(還原糖轉(zhuǎn)化率(%)= 還原糖產(chǎn)量 × 0.9 ×100/(1000 × 滸苔總糖含量))見(jiàn)圖1, 公式中0.9為換算系數(shù)[16]。滸苔稀硫酸水解殘留物經(jīng)酶解后還原糖轉(zhuǎn)化率見(jiàn)圖2。

表1 滸苔經(jīng)不同濃度稀硫酸水解不同反應(yīng)時(shí)間后的還原糖產(chǎn)量、滸苔稀硫酸水解殘留物經(jīng)酶解后還原糖產(chǎn)量以及還原糖總產(chǎn)量Tab.1 Release of reducing sugars from fresh U.prolifera (after dilute sulfuric acid hydrolysis; after enzymatic hydrolysis; reducing sugars of the two steps)

3 討論

DNS比色法測(cè)定滸苔總糖含量高達(dá) 67.2%, 進(jìn)行燃料乙醇發(fā)酵開(kāi)發(fā)具有較好前景。稀硫酸水解和纖維素酶酶解是主要的生物質(zhì)糖化工藝, 稀硫酸水解能夠得到一部分還原糖, 并破壞剩余多糖的結(jié)構(gòu), 從而有利于后續(xù)的纖維素酶酶解進(jìn)一步釋放還原糖[16]。

圖1 滸苔經(jīng)稀硫酸水解后的還原糖轉(zhuǎn)化率Fig.1 Conversion rate of reducing sugars after dilute sulfuric acid hydrolysis of fresh U.prolifera

圖2 滸苔稀硫酸水解殘留物經(jīng)酶解后的還原糖轉(zhuǎn)化率Fig.2 Conversion rate of reducing sugars after enzymatic hydrolysis of fresh U.prolifera residues obtained with dilute sulfuric acid hydrolysis

在121℃高溫高壓條件下, 用不同濃度的稀硫酸經(jīng)不同反應(yīng)時(shí)間水解滸苔, 對(duì)滸苔水解殘留物再進(jìn)行過(guò)量纖維素酶酶解。如圖1所示, 單獨(dú)的稀硫酸水解工藝即可得到很高的滸苔還原糖轉(zhuǎn)化率。隨著反應(yīng)時(shí)間的增加, 不同濃度的稀硫酸條件下還原糖產(chǎn)量均明顯增加, 但還原糖產(chǎn)量增加幅度隨稀硫酸反應(yīng)時(shí)間的增加而減小, 并最終停止增長(zhǎng), 這是由于部分還原糖在高溫高壓條件下會(huì)轉(zhuǎn)變成糠醛等副產(chǎn)物[14,16]。在硫酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.8%、反應(yīng)時(shí)間為90 min條件下, 還原糖轉(zhuǎn)化率可達(dá)59.9%, 此時(shí)每克干質(zhì)量滸苔可產(chǎn)生447.0 mg還原糖(表1), 此條件可以作為滸苔稀硫酸水解工藝的最佳條件。

如圖2所示, 稀硫酸水解殘留物的纖維素酶酶解工藝中, 滸苔還原糖轉(zhuǎn)化率很低, 在硫酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.6%、水解時(shí)間為60 min的時(shí)候還原糖轉(zhuǎn)化率出現(xiàn)最大值, 僅為 6.5%, 此時(shí)每克干質(zhì)量滸苔只產(chǎn)生了48.8 mg還原糖(表1)。隨稀硫酸濃度提高, 殘留物經(jīng)纖維素酶酶解產(chǎn)生的還原糖反而減少, 表明單獨(dú)的稀硫酸水解工藝釋放還原糖已較為充分。另外, 滸苔多糖中纖維素含量較低可能也是造成酶解釋放還原糖效果較差的原因[6]。麥秸干基中含有70%以上的纖維素, 在硫酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.5%、反應(yīng)90 min條件下每克干物質(zhì)可產(chǎn)生約330 mg還原糖, 酸處理后經(jīng)纖維素酶酶解最多可再產(chǎn)生197.1 mg還原糖[16],滸苔與麥秸相比在稀硫酸水解階段產(chǎn)還原糖較多,但后續(xù)酶解處理產(chǎn)糖量很少, 這種差異提示建立海藻原料的糖化工藝應(yīng)充分考慮海藻自身的生化組成特點(diǎn)。

滸苔稀硫酸水解產(chǎn)還原糖效果顯著, 而后續(xù)纖維素酶酶解的補(bǔ)充釋放效果不夠理想, 提示滸苔糖化工藝可單獨(dú)采用稀硫酸水解, 這樣可大大降低生產(chǎn)成本。在建立滸苔糖化工藝的基礎(chǔ)上, 可進(jìn)一步對(duì)滸苔進(jìn)行酒精發(fā)酵, 生產(chǎn)燃料乙醇。同樣的稀硫酸水解工藝條件下, 本文中的新鮮滸苔原料和后續(xù)研究中曬干之后貯存兩個(gè)月以上的滸苔原料得到的水解產(chǎn)糖結(jié)果存在明顯差異, 這提示了滸苔原料的新鮮程度對(duì)滸苔的酸解產(chǎn)糖也有較大影響, 在滸苔的曬干和貯存過(guò)程中, 自然界存在的白腐菌[20]、其他微生物對(duì)滸苔的分解消化作用以及滸苔自身的物理化學(xué)變化可能是造成這種差異的原因。滸苔多糖中含有鼠李糖、葡萄糖、木糖、半乳糖、甘露糖和糖醛酸等單糖[21], 后續(xù)研究中將具體研究滸苔稀硫酸水解工藝中各個(gè)單糖的產(chǎn)量和變化, 為滸苔燃料乙醇發(fā)酵提供更為細(xì)致的理論指導(dǎo)。

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