胡少南，趙 穎，鄭一敏，胥秀英

(重慶理工大學(xué)藥學(xué)與生物工程學(xué)院，重慶 400054)

見(jiàn)血青Liparis nervosa(Thunb.)Lindl.［Ophrys nervosa Thunb.］為蘭科(Orchidaceae)羊耳蒜屬植物脈羊耳蘭的全草，在全世界熱帶與亞熱帶均有分布。在我國(guó)主要分布于西南、江西、湖南、福建、臺(tái)灣及兩廣地區(qū)，其味苦，性涼，具有止血涼血，清熱解毒的功效［1］，為民間常用的止血中草藥?，F(xiàn)代藥理研究表明，見(jiàn)血青多糖和總生物堿具有較好的抗氧化性和抑菌效果［2-3］。本課題組研究人員前期制備了見(jiàn)血青的水提取物和不同有機(jī)溶劑的萃取得到的極性部位，研究其對(duì)小鼠出血、凝血時(shí)間的影響及對(duì)大鼠各項(xiàng)血液凝集參數(shù)的影響。結(jié)果表明:見(jiàn)血青具有較好的止血、促凝血作用，推測(cè)其作用機(jī)制可能與增加FIB含量、抑制纖溶酶活性以及收縮血管有關(guān)［4］。為確保見(jiàn)血青合理有效的應(yīng)用，同時(shí)也為開(kāi)發(fā)新的藥用資源提供依據(jù)，本實(shí)驗(yàn)利用GC-MS技術(shù)對(duì)見(jiàn)血青的不同極性部位進(jìn)行分析，以期為進(jìn)一步全面認(rèn)識(shí)見(jiàn)血青化學(xué)成分和闡明其藥理作用提供參考依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 實(shí)驗(yàn)儀器

Aligent 6890 N型氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(美國(guó)安捷倫公司);電熱鼓風(fēng)干燥箱(重慶銀河試驗(yàn)儀器有限公司);高速粉碎機(jī)(廣州旭郎);RE-5298旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠);H-1650型離心機(jī)(湖南湘儀儀器有限公司);METTLER AE200S型電子天平(梅特勒-托利多儀器有限公司);柱層析硅膠(100～200目，200～300目)(山東煙臺(tái)江友硅膠開(kāi)發(fā)有限公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)材料

見(jiàn)血青于2010年9月購(gòu)自成都市中藥材市場(chǎng)，經(jīng)重慶市中藥研究院王昌華副研究員鑒定為蘭科植物脈羊耳蘭Liparis nervosa的干燥全草，憑證標(biāo)本存放于重慶市中藥研究院中藥標(biāo)本館。乙醇、石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、甲醇均為分析純(成都科龍化工試劑廠);丙酮、正己烷為色譜純(安徽時(shí)聯(lián)特種溶劑股份有限公司);水為蒸餾水。

1.3 GC-MS分析條件

1)氣相色譜條件:色譜柱為DB-5MS彈性石英毛細(xì)管柱(30 m×0.32 mm× 0.25 μm)，進(jìn)樣口溫度為260℃;程序升溫條件:初溫60℃，保持2 min，以5℃/min升至終溫160℃，保持1 min，繼續(xù)以10℃/min升至終溫240℃，保持2 min;載氣:He;流速為1.24 mL/min;進(jìn)樣量為1 μL;分流比為20:1。

2)質(zhì)譜條件:EI離子源，離子源溫度為200℃，電離能為70 eV，接口溫度為260℃，掃描范圍m/z:50～550，溶劑延遲為3 min。

1.4 樣品制備方法

將見(jiàn)血青干燥全草在60℃烘箱烘至恒重后粉碎，過(guò)40目篩。稱取干燥粉末10 g，置于平底燒瓶，加入70%乙醇100 mL，置80℃水浴回流提取2次，每次2 h，合并2次提取液后提取液以10 000 r/min離心除雜后，精密吸取2 mL至25 mL容量瓶中，用丙酮定容至刻度線，備測(cè)。其余溶液減壓濃縮得到浸膏，取浸膏使用干法上樣進(jìn)行硅膠柱層析，分別用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇和甲醇洗脫2～3個(gè)柱體積，分別得到4個(gè)流分(Frs.1～4)。各流分減壓濃縮后分別轉(zhuǎn)移至25 mL容量瓶中，F(xiàn)rs.1用正己烷定容至刻度，F(xiàn)rs.2用丙酮-正己烷1∶1(V/V)混合液定容至刻度，F(xiàn)rs.3用丙酮-正己烷3∶1(V/V)混合液定容至刻度，F(xiàn)rs.4用丙酮定容至刻度，備測(cè)。

1.5 樣品測(cè)定

精密吸取供試品溶液5種，分別注入氣相色譜儀，對(duì)見(jiàn)血青各極性部位進(jìn)行GC-MS分析，得到見(jiàn)血青的GC-MS總離子流圖。啟動(dòng)P6890MS化學(xué)工作站，通過(guò)NIST05-Wiley275質(zhì)譜庫(kù)自動(dòng)檢索上述5個(gè)樣品的質(zhì)譜數(shù)據(jù)，確認(rèn)5種供試品溶液中的化學(xué)成分。各成分的相對(duì)百分含量根據(jù)總離子流圖由計(jì)算機(jī)采用面積百分比法計(jì)算得到。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

供試品溶液經(jīng)GC-MS聯(lián)用儀分析，得到見(jiàn)血青的GC-MS總離子流圖，見(jiàn)圖1～5。在確定各對(duì)照組分質(zhì)譜數(shù)據(jù)和掃描峰號(hào)后，用NIST譜庫(kù)進(jìn)行檢索，并核對(duì)標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜圖及有關(guān)資料，從見(jiàn)血青5種供試品溶液中共檢測(cè)出70個(gè)峰，將無(wú)標(biāo)準(zhǔn)譜核對(duì)結(jié)構(gòu)、含量較低和置信度低的組分、提取分離過(guò)程中混入的雜質(zhì)、溶劑中混入的雜質(zhì)組分舍去不用，共鑒定出45個(gè)化合物。其中:見(jiàn)血青石油醚部位7個(gè)，見(jiàn)表1;乙酸乙酯部位7個(gè)，見(jiàn)表2;正丁醇部位12個(gè)，見(jiàn)表3;甲醇部位5個(gè)，見(jiàn)表4;見(jiàn)血青70%乙醇提取液14個(gè)，見(jiàn)表5。

圖1 石油醚部位GC-MS總離子流圖

圖2 乙酸乙酯部位GC-MS總離子流圖

圖3 正丁醇部位GC-MS總離子流圖

圖4 甲醇部位GC-MS總離子流圖

圖5 70%乙醇提取液GC-MS總離子流圖

表1 見(jiàn)血青石油醚部位化學(xué)成分及相對(duì)含量

表2 見(jiàn)血青乙酸乙酯部位化學(xué)成分及相對(duì)含量

表3 見(jiàn)血青正丁醇部位化學(xué)成分及相對(duì)含量

表4 見(jiàn)血青甲醇部位化學(xué)成分及相對(duì)含量

表5 見(jiàn)血青70%乙醇提取液化學(xué)成分及相對(duì)含量

3 討論

本文采用GC-MS聯(lián)用技術(shù)對(duì)見(jiàn)血青不同極性部位的化學(xué)成分進(jìn)行了全面分析，共分離出70個(gè)峰，通過(guò)檢索鑒定了其中45種化合物。其中大多數(shù)為有機(jī)酸類、有機(jī)醇類、酚類、醛酮類以及酯類化合物，共29個(gè);其余組分中，含量較多的是一些含氮的有機(jī)化合物類，共8個(gè);含量較少的是一些萜類化合物，僅有2個(gè)。

見(jiàn)血青為瀕危蘭科羊耳蒜屬植物，同屬植物還有羊耳蒜、大唇羊耳蒜、香花羊耳蒜［5］等。已有文獻(xiàn)對(duì)羊耳蒜采用GC-MS進(jìn)行了化學(xué)成分研究，其中與本文檢測(cè)得到的成分相同的有2，3-二氫苯并呋喃、肉豆蔻酸、棕櫚酸［6］等，說(shuō)明同屬植物化學(xué)成分具有一定相似性，但在本文中檢測(cè)出胸腺嘧啶，是本課題前期實(shí)驗(yàn)中對(duì)見(jiàn)血青化學(xué)成分系統(tǒng)研究中分離得到的β-胸苷［7］的部分結(jié)構(gòu)，且其相對(duì)含量達(dá)到11.36%，由此推測(cè)見(jiàn)血青中可能含有較多的此類核苷。本實(shí)驗(yàn)為拯救瀕危蘭科藥用植物及做進(jìn)一步的科學(xué)研究起到積極作用，為全面認(rèn)識(shí)見(jiàn)血青化學(xué)成分和進(jìn)一步闡明其藥理作用提供參考依據(jù)。

［1］國(guó)家中醫(yī)藥管理局中華本草編委會(huì).中華本草(24卷)［M］.上海:上海科學(xué)技術(shù)出版社，1999.

［2］董艷芳，陳法志，郭彩霞，等.見(jiàn)血青多糖的抑菌活性與抗氧化性［J］.湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012，51(12):2570-2573.

［3］董艷芳，李偉陽(yáng)，葉睿超，等.見(jiàn)血青總生物堿的抑菌活性和抗氧化性研究［J］.四川大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版，2010，47(3):669-673.

［4］趙穎，胡少南，王昌華，等.見(jiàn)血青提取物止血作用的實(shí)驗(yàn)研究［J］.中國(guó)藥房，2013，24(31):2884-2886.

［5］關(guān)碌，王春蘭，肖培根，等.地生型蘭科藥用植物化學(xué)成分及其藥理作用研究［J］.中國(guó)中藥雜志，2005，30(14):1053-1061.

［6］劉杰書，李泳鋒，劉金龍.羊耳蒜中化學(xué)成分的氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析比較［J］.時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2010，21(3):529-530.

［7］趙穎，胡少南，王昌華，等.見(jiàn)血青化學(xué)成分研究［J］.中草藥，2013，44(21):2955-2959.