劉立平，曹 宇，蔡曉娜，賀曉強，范 開，

(1重慶理工大學藥學與生物工程學院，重慶 400054;2.重慶富進生物醫(yī)藥有限公司，重慶 400041)

胰島素作為一種治療1型糖尿病和2型糖尿病晚期的常用藥物之一，具有半衰期短的特點。經(jīng)過化學修飾，胰島素可在保持生物活性的同時延長半衰期［1-2］?；瘜W修飾劑的結(jié)構必須具有穩(wěn)定性、無毒性、無抗原性，并具有合適大小的相對分子質(zhì)量。聚乙二醇(polyethylene glycol，PEG)是一種具有較好生物相容性的高分子化合物，對人體無毒性。它是以-CH2CH2O-為基礎結(jié)構的大分子線性或分枝狀多聚物。用PEG對蛋白進行共價修飾可降低蛋白免疫原性，增加蛋白質(zhì)溶解度，并延長蛋白的半衰期［3］。目前FDA已批準多種PEG修飾的重組蛋白藥物上市，如Hoffmann的用于治療慢性丙型肝炎的PEG化的IFN a-2a(商品名為Somavert);Amgen的用于治療粒細胞減少的PEG化G-CSF(商品名為Neulasta);Enzon公司研發(fā)的用于治療白血病和黑色素瘤的PEG化于天冬酰胺(商品名為Oncaspar)。目前上市的特長效胰島素是將天然人胰島素B鏈第30位蘇氨酸去掉的胰島素類似物(命名為DET，結(jié)構見圖1)。然后在B鏈第29位賴氨酸(Lys)上結(jié)合一個14 C游離脂肪酸，脂肪酸可與血液中的白蛋白結(jié)合，形成白蛋白結(jié)合體，延長其作用時間［4］?，F(xiàn)有胰島素修飾研究多關于 B29 位［1，5-8］，本文嘗試修飾一種人胰島素類似物［9］的A1位甘氨酸位點。

mPEG有4種活性基團:mPEG-SPA、mPEGNHS、mPEG-NPC、mPEG-SC，后 3 種均易水解，在水溶液中半衰期短，僅能維持5～10 min，修飾效率低。而mPEG-SPA半衰期長，可維持30 min，且mPEG-SPA已用于多種上市PEG藥物修飾(如Oncaspa和Somavert)，偶聯(lián)后蛋白性質(zhì)穩(wěn)定，安全性高，故本文優(yōu)選mPEG-SPA作為最終的活性基團對DET進行修飾。mPEG-SPA修飾蛋白的原理是通過PEG與蛋白質(zhì)游離氨基反應，PEG上的活性基團琥珀酰亞銨基團(SPA)被蛋白質(zhì)游離氨基取代，聚乙二醇就與游離氨基以酰胺鍵共價結(jié)合(見圖2)。該反應是親核反應。親核反應時，當反應溶液的pH值與被偶聯(lián)的氨基pKa值相近時，該位點氨基最容易被修飾［10］;當反應溶液的pH值與其pKa值相差過大時，該位點氨基被質(zhì)子化，難被修飾。DET分子中有3個可作為單甲氧基聚乙二醇琥珀酰亞胺基丙酸酯(mPEG-succinimidyl propionate，mPEG-SPA)氨基修飾的位點:GlyA1(pKa≈8.0)α-氨基、PheB1(pKa ＜7.0)的 α-氨基、LysB29(pKa≈9.5)的 ε-氨基。

本文在pH=8.0時，選擇對DET分子中的GlyA1特異性用 PEG修飾(命名為PEG-DETA1)，但修飾過程中可能會有mPEG-SPA非特異性地修飾在LysB29或PheB1上，形成的相關物質(zhì)分別命名為PEG-DET-B29或PEG-DET-B1。修飾后通過陽離子Source 30Q層析得到PEG-DET-A1，并驗證其結(jié)構［11］。

圖1 去D30重組人胰島素類似物(DET)的結(jié)構

圖2 mPEG-SPA修飾原理

1 材料設備和方法

1.1.1 材料

乙腈、氯化鈉、相對分子質(zhì)量為20 kD的mPEG-SPA，購于北京鍵凱科技有限公司;DET來源于重慶富進生物醫(yī)藥有限公司;其他均為市售分析純試劑。

1.1.2 設備

AKTA Basic純化儀，購自GEhealth care公司;制備型預裝Source 30Q層析柱，購自GEhealth care公司;Agillent 1200型高效液相色譜儀;Dionex DNA Pac PA-100陰離子柱(4×250 mm，戴安中國有限公司);Welch Materials Ultimate?XB-C18色譜柱。

1.2 方法

1.2.1 PEG-DET-A1制備

取DET凍干粉50 mg用50 mm Tris-雙蒸水溶解，蛋白終濃度為10 mg/mL，總體積5 mL。精確稱量400 mg的分子量為20 kD的mPEG-SPA溶解在5 mL的乙腈中。將兩者等體積混合，精確調(diào)節(jié)pH=8.00，在室溫下緩慢攪拌反應1 h后，用陽離子Source 30Q分離純化，用SAX-HPLC高效液相色譜層析柱檢測。陽離子Source 30Q分離純化流動相A:2 L雙蒸水中加入50 mm PB、30%甲醇、pH 8.80;流動相B:流動相A中加入300 mm氯化鈉;檢測波長為280 nm，流速為20 mL/min，柱溫為室溫。制備過程(新自然段):首先用3個柱體積的流動相A沖洗制備型預裝Source 30Q層析柱，再將修飾后的樣品泵入制備型預裝Source 30Q層析柱，用3個柱體積的流動相A沖洗制備型預裝Source30Q層析柱，然后運行0% ～20%流動相B，20個柱體積的線性梯度洗脫，依次收集第1個峰(PEG-DET-A1)、第2個峰(PEG-DET-B29)、第3個峰(未被修飾的DET)，見圖3。把收集的第1個峰按1mL支分裝西林瓶，凍干熔封，得到PEGDET-A1蛋白樣品，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 PEG-DET-A1鑒定方法

1)SAX-HPLC分析。取一支PEG-DET-A1樣品用1 mL雙蒸水溶解后進樣20 μL，記錄色譜圖(圖4)。流動相A液 :Tris 6.057g加入約700 mL水溶解，用1M鹽酸調(diào)節(jié)pH值至9.0，再加入200 mL乙腈，混勻后用水稀釋至1 000 mL;B液:取A液500 mL，加入氯化鈉8.766 g。流速:0.5 mL/min;檢測波長:276 nm;柱溫:室溫;梯度洗脫程序見表1。

表1 梯度洗脫程序

2)質(zhì)譜分析。取一支PEG-DET-A1樣品用1 mL雙蒸水溶解后與5 mg/mL的HCCA基質(zhì)1 mL等體積1∶1混合后，委托重慶前沿生物公司進行質(zhì)譜分析，結(jié)果見圖5。

3)質(zhì)量肽圖分析

質(zhì)量肽圖分析法是修飾位點確認的常用方法之一，通過酶切比較修飾前樣品和修飾后樣品的肽段，消失或部分減少的肽段確認為被修飾的肽段，進而確認修飾位點。取DET和PEG-DET-A1各一支，分別用pH值為7.8的100 mm Tris-HCl pH 7.8溶解，稀釋濃度為1.0 mg/mL。各取樣100 μL 并加入 1 μg V8 酶酶切(酶切比例 100∶1)，37℃水浴反應8 h后立即進樣。采用Welch Materials Ultimate?XB-C18色譜柱;流速為1.0 mL/min;檢測波長為214 nm;柱溫為30℃;0.1%三氟乙酸-5%乙腈的水溶液為流動相A;0.1%三氟乙酸-95%乙腈溶液為流動相B;進行梯度洗脫。70 min內(nèi)流動相B從0%增至70%，用Aglient 1100 HPLC/MS液質(zhì)聯(lián)用色譜儀對各肽段進行質(zhì)譜分析，結(jié)果見圖6。

2 結(jié)果與分析

2.1 PEG-DET-A1制備結(jié)果

圖3中有多個峰，說明在形成所需PEG-DET-A1的同時還形成了閑逛物質(zhì)，并殘留了未修飾的DET。第1個峰為PEG-DET-A1，對應 SDS-PAGE中的 A1;第2個峰為PEG-DET-B29，對應 SDSPAGE中的 B29;第3峰為DET，第三孔 Marker。結(jié)合SDS-PAGE可看出:第1和2峰均為純度較高的分子量接近45kD的修飾物，且PEG-DET-A1、PEG-DET-B29、DET所占比例相當，因此可以進一步改進工藝，以提高PEG-DET-A1的比例。

圖3 Source 30Q柱層析圖

2.2 SAX-HPLC分析結(jié)果

將經(jīng)30Q柱層析收集所得的PEG-DET-A1進行SAX-HPLC分析，結(jié)果見圖4。由圖4可以看出:在保留時間10.121 min形成明顯單蜂，用面積歸一法測得純度為93.4%，初步肯定收集的PEGDET-A1為單一物質(zhì);在保留時間12.23 min為已相關物質(zhì)峰，所占比例較小，為6.6%。

圖4 PEG-DET-A1的SAX-HPLC純度分析

2.3 質(zhì)譜分析結(jié)果

取PEG-DET-A1樣品進行MALDI-TOF質(zhì)譜相對分子量的測定，結(jié)果見圖5。圖5顯示:PEGDET自制對照品質(zhì)譜分子量測定值為25 245.07 Da，與理論值25 706.64 Da相差446 Da。聚乙二醇是以乙二醇為單位的多聚物，具有多分散性。根據(jù)聚乙二醇的特點，其較難質(zhì)子化，因此在做聚乙二醇的質(zhì)譜時(特別是大分子量的聚乙二醇)都存在一定的偏差。本文中PEG-DETA1測定值和理論值誤差僅為1.7%，在合理偏差范圍內(nèi)，因此可認為本文中PEG-DET-A1是由一個分子的DET偶聯(lián)一個PEG制備而成。

圖5 PEG-DET-A1質(zhì)譜分子量

2.4 質(zhì)量肽圖分析結(jié)果

MALDI-TOF/TOF質(zhì)譜分子量測定確定了制備的PEG-DET-A1是一個分子的DET偶聯(lián)一個PEG制備而成，但還不能確定PEG偶聯(lián)在DET上氨基酸的具體位置。通過質(zhì)量肽圖分析可知:DET用V8酶酶切后，用Aglient 1100 HPLC/MS液質(zhì)聯(lián)用色譜儀測定共有5個肽段峰(圖6(a))，通過與DET酶切理論肽段分子量比較分析(表2)，確證5個肽段的分子量測定值與理論值一致。PEG-DETA1(圖6(b))與DET質(zhì)量肽圖中的2、3、4號肽段保留時間一致，PEG-DET-A1中1號肽段消失，在57.468 min處增加了一個新肽段，原因是PEG修飾了DET的1號肽段，進而增強了1號肽段的非極性，造成1號肽段保留時間延長，因此推斷出1號肽段被PEG修飾。在1號肽段中，只有A1位甘氨酸殘基可被PEG修飾，即PEG-DET-A1為1個PEG分子修飾在一個DET分子的A1位甘氨酸殘基形成的。

圖6 質(zhì)量肽圖

3 結(jié)束語

通過修飾和純化工藝，可獲得較高純度的PEG-DET-A1樣品，經(jīng)進一步純化即可獲得純度更高的藥用級的蛋白。本工藝可為同類蛋白藥物的放大生成提供參考。針對PEG化蛋白藥物修飾位點的鑒定，質(zhì)量肽圖分析法是最靈敏、最高效的方法。通過質(zhì)量肽圖分析法鑒定本工藝制備的PEG-DET-A1蛋白，結(jié)果表明 PEG確實修飾在DET蛋白A鏈的第1位甘氨酸上，和設計的修飾位點一致。同時，理論上PEG-DET-A由于分子量比較大，與胰島素受體結(jié)合力減弱，不能快速經(jīng)腎臟排泄，經(jīng)肝臟的代謝滅活速度減慢，進一步延長了在血液中的保留時間，可實現(xiàn)PEG-DET的長效降血糖的目的。因此，PEG-DET-A1可作為一種治療1型和2型糖尿病的長效胰島素候選藥物。

［1］高劍坤.一種新型長效人胰島素類似物的研制［D］.重慶:重慶大學，2007.

［2］Walsh G.Second-generation biopharmaceuticals［J］.European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics，2004，58:185-196.

［3］Pasut G，F(xiàn)rancesco M.Veronese.State of the art in PEGylation:The great versatility achieved after forty years of research［J］.Journal of Controlled Release，2012，161:461-472.

［4］竇懷智，單修飾聚乙二醇化胰島素的研究［D］.上海:復旦大學，2008.

［5］J·M·比爾斯，G·B·庫特勒.聚乙二醇化的賴脯胰島素化合物［P］.中國專利 CN10265884A，2012.09.12.

［6］印春華，竇懷智，張敏.一種單修飾的聚乙二醇化胰島素及其制備方法［P］.中國專利CN200610118923.2，2007.05.30.

［7］Bartley P C，Bogoev M，Larsen J，et al.Long-term efficacy and safety of insulin detemir compared to neutral protamine Hagedorn insulin in patients with Type 1 diabetes using a treat-to-target basal-bolus regimen with insulin aspart at meals:a 2-year，randomized，controlled trial［J］.Diabet Med，2008(25):442-449.

［8］Jonassen I，Hoeg-Jensen T，Havelund S，et al.New insulin derivative comprising a naturally occurring insulin with a side chain attached to the alpha-amino or epsilonamino in the B chain of the parent insulin，useful in composition for treating diabetes［P］.PCT，.WO2005012347-A2.

［9］Vajo Z，F(xiàn)awcett J，Duckworth W C.Recombinant DNA Technology in the Treatment of Diabetes:Insulin Analogs［J］.Endocr Rev，2001，22(5):706-717.

［10］Roberts M J，Bentley M D，Harris J M.Chemistry for peptide and protein PEGylation［J］.Adv Drug Deliv Rev，2002，54(4):459-476.

［11］吳志民.胰島素的mPEG修飾及其活性表征［J］.化學學報，2011，69(23):2889-2895.