賀曉強(qiáng)，范 開，，蔡曉娜，劉立平，陳 清

(1.重慶理工大學(xué)藥學(xué)與生物工程學(xué)院，重慶 400054;2.重慶富進(jìn)生物醫(yī)藥有限公司，重慶 400041)

促胰島素分泌肽(glucogan-like peptide-1，GLP-1)是一種主要由腸道L細(xì)胞分泌，由30個氨基酸殘基組成的肽類激素。由于其相對分子質(zhì)量小，在體內(nèi)容易被二肽基肽酶-IV降解和被循環(huán)系統(tǒng)清除，且具有免疫原性和抗原性，因此在臨床應(yīng)用上受到限制［1-3］。

聚乙二醇化(polyethylene glycol，PEG)修飾可起到延長藥物半衰期、降低藥物的免疫原性和抗原性、減少循環(huán)系統(tǒng)清除速率的作用。隨著PEG修飾技術(shù)的發(fā)展，定點修飾已經(jīng)成為趨勢，而修飾劑馬來酰亞胺活化單甲氧基聚乙二醇(PEG Maleimide，mPEG-mal)就是最常用的修飾劑之一［4-6］。

艾塞那肽(商品名為Byetta)是含39個氨基酸的人工合成的多肽，它和天然的GLP-1有53%的同源性，都可以與GLP-1受體結(jié)合并激活，且不會被體內(nèi)二肽基肽酶-IV降解，延長了半衰期［7-10］。Byetta(39肽)的氨基酸序列為HGEGTFTSDLSKQMEEE AVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPS。 將Byetta最后一個氨基酸絲氨酸替換成一個半胱氨酸C(簡稱ByC39)，利用化學(xué)合成法合成，氨基酸序列為HGEGTFTSDLSKQMEEE AVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPSC;然后用 mPEG-mal-40 kDa對ByC39進(jìn)行定點修飾。根據(jù)文獻(xiàn)［11-12］，mPEG-mal-40 kDa在pH值為6.0～7.0的修飾緩沖體系中能特異地偶聯(lián)在蛋白或者多肽游離巰基上。因此，本文通過研究修飾pH值、修飾緩沖體系，以及修飾保護(hù)劑，對修飾條件進(jìn)行優(yōu)化。

1 材料和方法

1.1 材料與儀器

原料:馬來酰亞胺活化單甲氧基聚乙二醇，相對分子質(zhì)量為40 kDa(mPEG-mal-40kDa)，采購于北京鍵凱科技有限公司;ByC39多肽委托成都凱捷生物醫(yī)藥科技發(fā)展有限公司化學(xué)合成，純度都在98%以上。

主要試劑:乙酸(CH3COOH)，乙酸鈉(CH3COONa)，三(2-羧乙基)膦(TCEP)，乙二胺四乙酸(EDTA)，賴氨酸(Lys)，均購于上海生工生物工程技術(shù)有限公司。

主要儀器:AKTA Basic100純化儀，美國 GE公司;島津LC-15C型高效液相色譜，日本島津;SP Sepharose F.F陽離子純化填料，Source 15RPC填料，美國 GE公司;Agilent 1120-LC-MS，德國 Agilent公司;實驗用水均采用Rios超純水系統(tǒng)處理。

1.2 試驗方法

1.2.1 修飾pH

ByC39多肽通過SP陽離子層析柱回收后，用pH 值為6.0、6.5、7.0 的 50 mmol/L CH3COONa-CH3COOH緩沖液稀釋3份終濃度為1.0 mg/mL的樣品，按照ByC39多肽與mPEG-mal-40kDa修飾劑反應(yīng)摩爾比為1∶3的比例加入 mPEG-mal-40kDa修飾劑，25℃反應(yīng)4 h，用RP-HPLC分析修飾率和SDS-PAGE檢測。

1.2.2 修飾緩沖體系

ByC39多肽通過SP陽離子層析柱回收后，用pH值為6.5的50 mmol/L CH3COONa-CH3COOH、50 mmol/L NaH2PO4-Na2HPO4緩沖劑分別稀釋樣品至1.0 mg/mL，按照ByC39多肽與mPEG-mal-40kDa修飾劑反應(yīng)摩爾比為1∶3的比例加入mPEG-mal-40kDa修飾劑，25℃反應(yīng) 4 h，用 RPHPLC分析修飾產(chǎn)物。

1.2.3 修飾保護(hù)劑

ByC39多肽通過SP陽離子層析柱回收后，取同樣 2份，用 pH值為6.5的 50 mmol/L CH3COONa-CH3COOH緩沖稀釋樣品濃度至1.0 mg/mL。按照ByC39多肽與mPEG-mal-40kDa修飾劑反應(yīng)摩爾比為1∶3的比例加入mPEG-mal-40kDa修飾劑，其中一個同時補(bǔ)入終濃度為2.0 mmol/L的Lys和5.0 mmol/L EDTA，另外一個不加任何試劑做對照。25℃反應(yīng)4 h后，用TFA將pH值調(diào)為3.0，終止反應(yīng)，取樣進(jìn)行RP-HPLC分析。

2 實驗結(jié)果

2.1 SDS-PAGE和RP-HPLC檢測結(jié)果

1)SDS-PAGE檢測不同修飾pH值(6.0～7.0)對修飾率的影響，結(jié)果如圖1所示。

圖1 不同修飾pH值(6.0～7.0)凝膠電泳圖

2)RP-HPLC檢測不同修飾pH值(6.0～7.0)對修飾率的影響，如圖2～4所示。

圖2 pH=6.0時修飾結(jié)果

圖3 pH=6.5時修飾結(jié)果

在 pH值為6.0、6.5、7.0時修飾率分別為70%、95%、76%。前期研究發(fā)現(xiàn)PEG-ByC39在高pH值緩沖條件下蛋白性質(zhì)不太穩(wěn)定，從提高修飾率、增加PEG-ByC39的穩(wěn)定性考慮，選擇pH值為6.5作為修飾條件，這樣既能達(dá)到高修飾率，又能保持蛋白的穩(wěn)定性質(zhì)。

圖4 pH=7.0時修飾結(jié)果

2.2 RP-HPLC檢測2種緩沖體系對ByC39與mPEG-mal-40kDa修飾結(jié)合率的影響

經(jīng)RP-HPLC分析(見圖5)，pH值為6.5的CH3COONa-CH3COOH緩沖體系和NaH2PO4-Na2HPO4緩沖體系對修飾效率影響非常小，說明蛋白在這2種緩沖中都很穩(wěn)定。但是PEG-ByC39的前期穩(wěn)定性研究表明其在醋酸鹽緩沖最為穩(wěn)定，因此選擇 pH值為6.5的 CH3COONa-CH3COOH緩沖液進(jìn)行修飾。

圖5 不同緩沖體系中的修飾結(jié)果

2.3 RP-HPLC檢測修飾保護(hù)劑的不同對修飾率的影響

經(jīng)RP-HPLC分析(見圖6)，2種修飾產(chǎn)物保留時間和修飾后的百分比基本一致，說明添加Lys和EDTA對目的產(chǎn)物的修飾率和修飾產(chǎn)物沒有太大影響。但是考慮到修飾過程中可能出現(xiàn)非特異性修飾或修飾不均一等情況，決定加入2.0 mmol/L Lys和5.0 mmol/L EDTA作為修飾保護(hù)劑。

3 優(yōu)化條件

通過上述實驗，在采用分子量為40 kDa的mPEG-mal修飾ByC39多肽時，得到優(yōu)化的修飾緩沖條件為:

①選擇在pH值為6.5的條件下進(jìn)行修飾。

②選擇pH值為6.5的CH3COONa-CH3COOH緩沖液進(jìn)行修飾。

③選擇在終濃度為2.0 mmol/L的Lys和5.0 mmol/L的EDTA的保護(hù)劑環(huán)境中進(jìn)行修飾。

通過這些條件的優(yōu)化，可以提高修飾率以及增加修飾產(chǎn)物的穩(wěn)定性。

圖6 不同保護(hù)劑修飾后的結(jié)果

4 討論

聚乙二醇(PEG)是一類擁有良好水溶性的大分子聚合物，修飾后的多肽和蛋白質(zhì)類藥物可增加藥物的穩(wěn)定性，延長藥物的半衰期，降低免疫原性等。近年來在聚乙二醇定點修飾領(lǐng)域的研究也取得了較大的進(jìn)步，考慮到修飾條件在修飾過程中對修飾率、修飾產(chǎn)物、蛋白的穩(wěn)定性等方面都有較大的影響，因此修飾條件的優(yōu)化研究對開拓新藥研究也具有重要的意義。

艾塞那肽由禮來和Amylin兩家公司共同研發(fā)并于2005年6月由美國FDA批準(zhǔn)上市。它通過促胰島素釋放和抑制胰高血糖素釋放、延緩胃排空、抑制食欲和改善β細(xì)胞功能等作用來調(diào)節(jié)血糖濃度，但是每日需要注射1次或2次，過短的半衰期限制了其在臨床上的運(yùn)用。聚乙二醇定點修飾后可延長其在體內(nèi)的半衰期且活性不會降低，可以克服其在臨床運(yùn)用的缺陷，修飾后可達(dá)到長效的臨床效果，具有很好的研究前景。本研究通過對修飾條件的優(yōu)化，修飾率可達(dá)95%且修飾產(chǎn)物具有單一性，避免了在修飾過程中的一些非特異性的偶聯(lián)以及自身形成二聚體的風(fēng)險，達(dá)到定點修飾產(chǎn)物單一性的目的，并且可提高修飾產(chǎn)物的穩(wěn)定性，延長半衰期，降低藥物免疫原性和抗原性，進(jìn)而解決胰島素在體內(nèi)的一些問題。但是對PEG化后的藥物在體內(nèi)藥物代謝動力學(xué)性質(zhì)還需進(jìn)一步研究，以監(jiān)控藥物在體內(nèi)的不良反應(yīng)。本研究為新藥的開發(fā)和臨床應(yīng)用研究提出新的方向。

［1］Kieffer T J.Gastro-intestinal hormones GLP and GLP-1［J］.Ann Endocrinol，2004，65(1):13-21.

［2］Holst J J.Glucagon-like peptide 1(GLP-1):an intestinal hormone，signalling nutritional abundance，with an unusual therapeutic potentian［J］.Trends Endocrinol Metab，1999，10(6):229-235.

［3］McDannell M E.Combination therapy with new targets in type 2 diabetes:a review of available agents with a focus on pre-exercise adjustment［J］.J Cardiopulm Rehabil Prev，2007，27:193-201.

［4］Abuchowski A，Van Es T，Palczuk N C，et al.Alteration of immunological properties of bovine serum albumin by covalent attachment of polyethylene glycol［J］.J Biol Chem 1977，252(11):3578-3581.

［5］Veionses F M，Pasut G.PEGylation，successful approach to drug delivery［J］.Drug D iscov Today，2005，10(21):1451-1458.

［6］吳潔，劉景晶，胡卓逸.蛋白質(zhì)藥物的聚乙二醇修飾［J］.藥學(xué)進(jìn)展，2002，26(3):146-151.

［7］Kolterman O G，Kim D D，Shen L，et al.Pharmacokinetics，pharmacodynamics，and safety of exenatide in patients with type 2 diabetes mellitus［J］.Am J Health Syst Pharm，2005，62:173-181.

［8］Elliott R M，Morgan L M，Tredger J A，et al.Glucagonlike peptide-1(7-36)amide and glucose dependent insulinotropic polypeptide secretion in response to nutrient ingestion in man:acute post prandial and 24h secretion patterns［J］.J Endocrinol，1993，138(1):159-166.

［9］孫玉昆，伍登熙，朱志勇，等.促胰島素分泌肽衍生物:中國，1363559［P］，2002-08-14.

［10］Eng J，Kleinman W A，Singh I，et al.Isolation and characterization of exendin-4，an exendin-3 analogue，from Heloderma suspectum venom:further evidence for an exendin receptor on dispenscd acini from guinea pig pancreas［J］.Biol Chen，1992(11):7402-7406.

［11］Greenwald R B.Poly(ethylene glycol)conjugated drugs and prodrugs:a comprehensive review［J］.Crit.Rev.T-her.Drug Carrier Syst.，2000(17):101-161.

［12］Balan S，Choi J W，Godwin A，et al.Site-pecific PEGylation of protein disulfide bonds using a three-carbon bridge［J］.Bioconjug.Chem，2007(18):61-76.