張媛媛，徐康康

(1.江蘇省腫瘤醫(yī)院藥劑科，江蘇 南京 210009;2.南京醫(yī)科大學(xué)南京兒童醫(yī)院醫(yī)學(xué)裝備部，江蘇南京 210008)

甲氨蝶呤(methotrexate，MTX)為葉酸類抗腫瘤藥，臨床上廣泛用于治療急性淋巴細(xì)胞白血病、淋巴瘤、絨毛膜上皮癌和骨肉瘤等惡性腫瘤。大劑量甲氨蝶吟(High Dose Methoterxate，HD-MTX)結(jié)合甲酰四氫葉酸鈣(Calcium Folinate，CF)解救是目前急性淋巴細(xì)胞白血病、惡性淋巴瘤、骨肉瘤的重要治療方案之一［1-2］。HDMTX化療需要實(shí)施MTX血藥濃度監(jiān)測，指導(dǎo)解救藥物CF的合理使用，避免MTX對患者造成的嚴(yán)重毒副作用［3-4］。

當(dāng)前，國內(nèi)外檢測生物樣品中MTX濃度的方法主要有免疫法和高效液相色譜法［5］。高效液相色譜法可將藥物與代謝產(chǎn)物以及內(nèi)源性物質(zhì)分離，具有專一性強(qiáng)的特點(diǎn)，是檢測MTX血漿濃度的金標(biāo)準(zhǔn)，但該法需復(fù)雜的前處理過程和較長的測定時(shí)間，不適合大樣本的快速檢測。盡管免疫法一定程度上會(huì)受到交叉反應(yīng)的影響，但是其憑借快速、易操作的優(yōu)點(diǎn)，已逐漸成為治療藥物監(jiān)測的主要方法。而在MTX的生物藥品檢測中，均相酶放大免疫分析法(EMIT)方法更是逐漸成為快速檢測甲氨蝶呤血藥濃度的主要方法，將替代過去常用的熒光偏振免疫分析法(FPIA)方法。該方法保留了操作簡便、自動(dòng)化程度高、測定周期短等特點(diǎn)，但其說明書中仍提示“該系統(tǒng)在測定MTX時(shí)存在正偏差，MTX的一種代謝產(chǎn)物 4-氨基-4-脫氧-N-10-甲基喋酸(APA)的交叉反應(yīng)會(huì)使測定值被高估”。這三種方法各有其優(yōu)缺點(diǎn)，各有所長。本文希望通過對相同一份樣品分別經(jīng)3種方法分別檢測的結(jié)果，討論方法因素是否會(huì)對甲氨蝶呤血藥濃度的檢測產(chǎn)生影響，希望找出最有可能影響檢測結(jié)果的方法。

1 材料

1.1 樣本的收集 收集急性淋巴細(xì)胞白血病和惡性淋巴瘤患兒經(jīng)HD-MTX化療后采集的血液樣本50份。將分離的血漿分成3份，于-45℃低溫保存，1周內(nèi)分別用HPLC法、FPIA法和EMIT法測定。

1.2 HPLC法儀器和試劑 Hp1100高效液相色譜儀;色譜柱為Zorbax SB-C18柱(4.6 mm ×250 mm，5 μm);流動(dòng)相:0.05 mol·L-1磷酸鹽緩沖液(pH 6.8)/甲醇(體積比 78/22)，流速:1.0 mL·min-1，柱溫:40℃，檢測波長:306 nm。甲氨蝶呤對照品(中國藥品生物制品檢定所，批號100138-200603)。

精密稱取甲氨蝶呤對照品適量，置于100 mL容量瓶中，用 0.05 mol·L-1磷酸鹽緩沖液(pH6.8)溶解并稀釋至刻度。得約1 mmol·L-1的MTX對照品儲(chǔ)備液。置4℃冰箱保存，臨用前稀釋成所需濃度。

1.3 FPIA法儀器和試劑 雅培公司TDx-FLx藥物濃度分析儀，Methotrexate II定標(biāo)(批號80226Q 100)，Methotrexate II質(zhì)控(批號94049Q100)，Methotrexate II試劑(批號90359Q101)。

1.4 EMIT法儀器和試劑 西門子公司Viva-E全自動(dòng)藥物濃度監(jiān)測系統(tǒng)，Emit?Methotrexate定標(biāo)(批號6L119UL-E1)，BIO-RAD Lyphochek?治療藥物監(jiān)測質(zhì)控(批號51793)，Emit? Methotrexate試劑(批號6L119UL-E1)。

2 方法

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線 取空白血漿200 μL，準(zhǔn)確加入MTX儲(chǔ)備液，配制成相當(dāng)于血中MTX濃度分別為0.0495，0.099，0.198，0.495，0.694，0.991 μmol·L-1的樣品系列，經(jīng)HPLC法繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。利用TDx-FLx和Viva-E血藥濃度測定儀配套定標(biāo)溶液繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.2 精密度 選擇高中低3個(gè)濃度的質(zhì)控樣品各一份，每份樣品均由各自配套的儀器連續(xù)一日內(nèi)連續(xù)測定6次和連續(xù)6日測定，分別計(jì)算日間和日內(nèi)精密度。其中TDx-FLx和Viva-E血藥濃度測定儀分別選擇配套質(zhì)控樣品，HPLC法選取“2.1”項(xiàng)下高中低三個(gè)濃度的溶液作為質(zhì)控樣品。

2.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 選取“2.2”項(xiàng)下各質(zhì)控樣品，在0 d，-45℃冷凍4、7 d后，分別在HPLC、TDx-FLx和Viva-E血藥濃度測定儀上測定，考察穩(wěn)定性。

2.4 MTX血漿藥物濃度的測定 選用EDTA-K2抗凝靜脈血標(biāo)本，離心分離血漿，先后在 HPLC、TDx-FLx和Viva-E血藥濃度測定儀上測定血漿中甲氨蝶呤濃度。每批次測定樣本時(shí)需對質(zhì)控品進(jìn)行平行測定。

2.5 數(shù)據(jù)分析 分別用HPLC、TDx-FLx和 Viva-E血藥濃度測定儀測定血漿中MTX濃度，樣本的正態(tài)性檢驗(yàn)采用Kolmogorov-Smimov法。如符合正態(tài)分布，利用配對樣本t檢驗(yàn)兩兩考察測定結(jié)果間是否存在差異，利用Deming回歸兩兩考察測定方法之間的相關(guān)性;如不符合正態(tài)分布，則用Friedman檢驗(yàn)和Wilcoxon檢驗(yàn)等非參數(shù)檢驗(yàn)方法和Passing-Bablok回歸法進(jìn)行分析。利用Bland-Altman偏差圖比較兩法測定結(jié)果均值的高低。

3 結(jié)果

3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線 HPLC法按“2.4”項(xiàng)方法處理后進(jìn)樣分析，以MTX峰面積Y對濃度X(μmol·L-1)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程:Y=17 205.3X-4 005.96。r=0.999 7。FPIA 和 EMIT 法采用各自定標(biāo)溶液，由系統(tǒng)自動(dòng)獲取。

3.2 精密度測試結(jié)果 三種測定儀器均具有較好的批內(nèi)和批間精密度，CV均＜7.50%(結(jié)果見表1)，其中在低濃度區(qū)間方法的精密度稍差。HPLC法三個(gè)水平質(zhì)控品的質(zhì)控品濃度分別為0.049 5，0.495，0.99 μmol·L-1;TDx-Flx 三個(gè)水平質(zhì)控品的質(zhì)控品濃度分別為 0.07，0.40，5.00 μmol·L-1;Viva-E系統(tǒng)三個(gè)水平質(zhì)控品的質(zhì)控品濃度分別為0.32，1.18，8.84 μmol·L-1。

表1 兩種儀器的日內(nèi)、批間精密度的測定結(jié)果(n=6)

3.3 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果 穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果顯示:樣品經(jīng)凍融后，分別經(jīng)三種檢測方法復(fù)測，檢測結(jié)果穩(wěn)定(CV＜7%)。HPLC、FPIA和EMIT法檢測甲氨蝶呤的測定結(jié)果分別為(0.49 ±0.55)、(0.48 ±0.54)、(0.60 ±0.56)μmol·L-1。

3.4 數(shù)據(jù)分析 經(jīng)Kolmogorov-Smirmov檢驗(yàn)(P=0.011，P=0.017，P=0.014)，三組數(shù)據(jù)均符合正態(tài)分布。兩兩比較的差值配對 t檢驗(yàn)結(jié)果(PHPLCvsFPIA=0.313，PHPLCvsEMIT＜0.01，PFPIAvsEMIT＜0.01)，提示HPLC法與FPIA法沒有顯著差別，而其它倆組都存在顯著差別。

利用Bland-Altman偏差圖比較兩法測定結(jié)果均值的高低(圖1)，結(jié)果顯示:FPIA法測定結(jié)果較HPLC 法低 0.01 mmol·L-1(95%CI:-0.09 ～0.10 mmol·L-1);HPLC法測定結(jié)果較EMIT法低0.11 mmol·L-1(95%CI:-0.23 ～ 0.01 mmol·L-1);FPIA法測定結(jié)果較 EMIT法低0.12 mmol·L-1(95%CI:-0.23 ～ -0.01 mmol·L-1)。

經(jīng)Deming回歸法分析三種測定方法(圖2)，Spearman檢驗(yàn)兩兩考察不同測定方法結(jié)果的相關(guān)性:YHPLC=1.00 XFPIA+0.015(r=0.978，P ＜0.000 1);YHPLC=0.94XEMIT-0.079(r=0.956，P ＜0.000 1);YFPIA=0.95XEMIT-0.089(r=0.927，P ＜0.000 1)。

圖1 三種測定方法測定結(jié)果的Bland-Altman圖

圖2 三種測定方法測定結(jié)果的Deming回歸曲線

4 討論

FPIA是根據(jù)熒光偏振原理建立的一種免疫分析方法，EMIT是一種酶放大免疫分析技術(shù)，二者均是利用免疫學(xué)原理進(jìn)行特異性分析，測定結(jié)果會(huì)不同程度地受到的甲氨蝶呤兩種代謝產(chǎn)物——APA和7-OH甲氨蝶呤(7-OH MTX)的交叉反應(yīng)而影響［6-8］。HPLC法作為色譜分析法的一種，可以將藥物原型及其代謝產(chǎn)物分離后，準(zhǔn)確測定甲氨蝶呤的濃度，不受代謝物的影響。目前尚無研究同時(shí)考察三種測定方法，確定交叉反應(yīng)引起的偏差大小。

許耘川［9］提示FPIA和HPLC法測定甲氨蝶呤血藥濃度的結(jié)果之間不存在顯著性差異。劉思婷［6］證實(shí) EMIT方法比 FPIA法存在正偏差約0.2 mmol·L-1。吳先闖［10］的研究說明 EMIT 法比HPLC法存在約0.12 mmol·L-1的正偏差。但這種若干組兩兩比較的結(jié)果基于不同的待測樣品，且樣品數(shù)目也不同，無法通過偏差傳遞確定三種方法之間的大小關(guān)系。本文選用相同樣本分別用三種方法分別測定，同時(shí)利用多配對樣本的非參數(shù)檢驗(yàn)方法，考察了三種檢測方法之間的差異，用Bland-Altman圖形直觀的反映該差異［11］，同時(shí)通過回歸分析法定量描述了不同檢測方法間的換算關(guān)系。

由于地區(qū)發(fā)展水平不一致，色譜法和免疫法都將在甲氨蝶呤的治療藥物監(jiān)測工作中發(fā)揮作用，討論不同方法間的差異可以提高對于治療藥物監(jiān)測數(shù)據(jù)的臨床價(jià)值。隨著新技術(shù)的發(fā)展，HPLC法和FPIA法由于各自的特點(diǎn)將在TDM工作中的應(yīng)用將減少，但既往的檢測結(jié)果仍具有很高的研究價(jià)值。只有定量分析了方法間的差異，才有可能對接既往數(shù)據(jù)和未來新的研究數(shù)據(jù)，對接不同研究單位之間的研究成果。對于新興的EMIT法的研究證實(shí)存在顯著的正偏差，因此需要在化療中考慮到這個(gè)因素，回歸分析結(jié)果可以幫助臨床工作者將EMIT法測定結(jié)果換算成FPIA或HPLC估算值，減少代謝物對于臨床治療的誤導(dǎo)作用。

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