徐瀚峰，王禮學，朱傳東，朱小方，丁 婕，俞 晨

(東南大學附屬第二醫(yī)院腫瘤科，江蘇南京 210003)

目前我國肝癌的發(fā)病率仍然較高，且呈不斷上升的趨勢。目前對于肝癌的診治方法較少，最重要的是早期發(fā)現(xiàn)，早期手術(shù)治療可以取得良好的療效，但是肝癌的早期診斷仍然困難，不少患者發(fā)現(xiàn)時已是晚期，目前反應原發(fā)性肝癌的早期診斷指標仍以AFP為主，但是有相當部分的患者肝癌早期AFP并不升高，且有30% ～40%的患者始終無AFP的明顯升高，且在多種原因引起的肝細胞損傷時也會出現(xiàn)AFP的升高，從而出現(xiàn)診斷偏差，因此我們需要發(fā)現(xiàn)更多的血清學標志物幫助肝癌的早期發(fā)現(xiàn)。高爾基體糖蛋白(Golgiprotein-73，GP73)是新近發(fā)現(xiàn)的一種肝癌相關(guān)蛋白，日益增多的研究表明，GP73在肝癌診斷中具有可能的應用價值，是一種潛在的血清腫瘤標志物［1－2］。AFP異質(zhì)體(AFP-L3)也是新近發(fā)現(xiàn)的肝癌相關(guān)指標。本研究探討聯(lián)合檢測血清GP73，AFP，AFP-L3 以及 α-L-巖藻糖苷酶(α-L-fucosidase，AFU)在肝癌診斷中的意義。

1 材料與方法

1.1 研究對象 選取2012年6月—2013年6月在我院住院的原發(fā)性肝癌患者81例，其中男性65例，女性16例，平均年齡(56.2±3.7)歲;肝硬化患者72例，男性57例，女性15例，平均年齡(53.8±4.2)歲;慢性乙型肝炎患者28例，男性20例，女性8例，平均年齡(42.1±2.8)歲，另選取我院門診健康體檢者27例做為健康對照組，其中男性19例，女性8例，平均年齡(43.8±1.8)歲。所有肝癌、肝硬化、慢性乙型肝炎患者的診斷均符合《原發(fā)性肝癌的臨床診斷與分期標準》及《慢性乙型肝炎防治指南》［3］。

1.2 方法 GP73測定采用德國EVOLIS酶聯(lián)免疫定量方法檢測，試劑盒由北京熱景生物技術(shù)有限公司提供，肝癌判定值為≥150 μg·L－1;試劑盒均在有效期內(nèi)，嚴格按照使用說明書操作。血清AFP濃度測定采用化學發(fā)光法，使用AXSYM試劑盒(美國ABBOTT公司)，并在全自動生化儀上進行測定;AFP異質(zhì)體測定經(jīng)過離心柱兩步清洗去除不結(jié)合AFP，再經(jīng)離心洗脫獲得AFP-L3，該離心柱由北京熱景生物技術(shù)有限公司提供，同樣在全自動生化儀上進行測定;AFU在全自動生化儀上進行測定。全自動生化儀為AEROSET(美國ABBOTT公司)產(chǎn)品。

1.3 標本采集 所有標本均在早晨收集空腹血，置于促凝管中3～4 mL，分離后獲得血清置于－20°冰箱中保存待檢。

1.4 統(tǒng)計方法 本數(shù)據(jù)采用Spss 19.0進行分析，由于高爾基體糖蛋白73、AFP-L3、AFP、AFU數(shù)據(jù)呈偏態(tài)分布，采用中位數(shù)(四分位數(shù))表示，計數(shù)資料采用卡方檢驗，P＜0.05為有統(tǒng)計學差異。

2 結(jié)果

2.1 各組檢驗結(jié)果統(tǒng)計 GP73正常值范圍0～150 μg·L－1，AFP-L3正常值范圍0～10%，AFP 正常值范圍0 ～13.4 μg·L－1，AFU 正常值范圍 2～25 U·L－1。各組檢驗結(jié)果采用中位數(shù)及四分位數(shù)表示，統(tǒng)計結(jié)果見表1。

2.2 各項檢驗指標的靈敏度、特異度、準確度 從檢驗指標中我們可以發(fā)現(xiàn)，在肝癌診斷中，單項檢測中特異度最高的為AFP-L3達到了88.8%，靈敏度最高的為 AFP達到了60.5% ，準確度最高的為AFP達到73.2%，而聯(lián)合檢測組中，特異度、靈敏度、準確度分別為 89.2%、60.5% 及77.03%，高于各單項檢查組。見表2。

表1 各組檢驗結(jié)果統(tǒng)計

表2 各單項檢測指標及聯(lián)合檢測的靈敏度、特異度、準確度

2.3 ROC曲線 GP73、AFP異質(zhì)體、AFP、AFU以及聯(lián)合檢測對肝癌鑒別診斷效果采用ROC曲線分析GP73、AFP-L3、AFP、AFU以及聯(lián)合檢測鑒別肝癌與非肝癌的效果，曲線下的面積分別為:0.704、0.704、0.701、0.559、0.765;各自的95%置信區(qū)間分別為:0.631 ～0.778、0.628 ～0.779、0.623～0.78、0.476 ～0.642、0.694 ～0.835(圖1)。通過 ROC 曲線分析將聯(lián)合檢測臨界值設(shè)定在:182.28(根據(jù)靈敏度+特異度最大原則)，此時的靈敏度為60.5%，特異度為89.2%。

圖1 ROC曲線圖

2.4 聯(lián)合檢測的卡方分析 對 GP73、AFP異質(zhì)體、AFP及AFU檢測指標與聯(lián)合檢測指標進行卡方檢驗，其P值遠小于0.05，因此在a=0.05的檢驗水準下，可以認為聯(lián)合檢測與各單項檢測相比有統(tǒng)計學差異。聯(lián)合檢測的陽性檢出率更高。見表3。

表3 各單項檢測指標與聯(lián)合檢測指標陽性率卡方分析

3 討論

原發(fā)性肝癌發(fā)病率位居我國前列，病死率居我國第2位，且有不斷上升的趨勢。大部分肝癌患者確診時已至晚期，表明目前常用的血清肝癌診斷標志物不能滿足臨床需求。AFP是常用的肝癌診斷指標，但是其敏感度僅為40%～65%，30%左右的肝癌患者AFP為陰性［4］。因此，需要進一步尋找有效的血清標志物來提高肝癌的早期診斷率。

近幾年報道GP73可能成為一種肝癌診斷的新型血清標志物。高爾基體糖蛋白(GP73)是存在于高爾基體的跨膜蛋白，Kladney等［5］在2000年首次發(fā)現(xiàn)該蛋白，該蛋白在肝細胞中表達很少，主要由膽管上皮細胞表達。Hann等［6］發(fā)現(xiàn)GP73在肝癌中升高尤為明顯，提示其可能成為肝癌的一個新的血清標志物。

AFP是一種糖蛋白分子，其糖鏈的合成與降解過程是在細胞內(nèi)進行的，經(jīng)糖基轉(zhuǎn)移酶和水解酶協(xié)同完成。其糖鏈結(jié)構(gòu)存在異質(zhì)性。經(jīng)小扁豆凝集素(LCA)親和電泳，AFP分成3個條帶，根據(jù)電泳遷移率大小依次為AFP-L1、AFP-L2和AFP-L3。肝癌發(fā)生時AFP糖鏈結(jié)構(gòu)可產(chǎn)生異質(zhì)性，與非惡性肝病產(chǎn)生的糖鏈結(jié)構(gòu)存在顯著差異，具有特異性，因而可以把AFP異質(zhì)體作為肝癌標記物，比AFP定量具有更高的特異性［7］。有研究表明，AFP-L3的測定不僅在良惡性肝病的鑒別診斷及原發(fā)性肝癌的早期診斷方面比AFP測定更有價值，而且可以作為肝癌的預后指標［8］。

α-L-巖藻糖苷酶(α-L-fucosidase，AFU)是一種溶酶體酸性水解酶，廣泛分布于人體內(nèi)各種組織、細胞及體液中，在肝、肺、腦、腎、胰、白細胞以及血清、尿液等中均含此酶，主要作用是催化含巖藻糖基的低聚糖、糖蛋白及糖苷的水解代謝，在免疫反應、信號轉(zhuǎn)導等多種方面發(fā)揮重要作用，多種研究發(fā)現(xiàn)，AFU的測定在多種疾病的診斷及治療中都有積極的作用［9］。研究表明，AFU可作為結(jié)直腸癌、口腔癌、肝癌等腫瘤早期診斷標志物及抗腫瘤治療效果的指示因子，已引起廣泛的關(guān)注［10］。1980年首先發(fā)現(xiàn)原發(fā)性肝癌患者血清AFU升高，具有較高的特異性和靈敏性，在多項研究中發(fā)現(xiàn)AFU可作為原發(fā)性肝癌的腫瘤標志物［11－12］。

本研究分別檢測了肝癌、肝硬化、慢性肝炎患者及健康體檢者的GP73、AFP、AFP-L3及AFU，通過聯(lián)合各項指標來觀察對于肝癌的診斷。在研究中發(fā)現(xiàn)，聯(lián)合檢測組中，特異度、靈敏度、準確度分別為 89.2%、60.5% 及 77.03%，均高于各單項檢測組。對高爾基體糖蛋白、AFP異質(zhì)體、AFP及AFU檢測指標與聯(lián)合檢測指標進行卡方檢驗，其P＜0.05，聯(lián)合檢驗與各單項檢驗相比有統(tǒng)計學差異。表明聯(lián)合檢驗的陽性檢出率更高。通過ROC曲線可以發(fā)現(xiàn)，聯(lián)合檢測組的線下面積最大為0.765，高于各單項組。因此可以發(fā)現(xiàn)聯(lián)合檢測有利于提高肝癌的早期檢出率，并有助于肝硬化、慢性肝炎相鑒別。

綜上所述，聯(lián)合檢測GP73、AFP-L3、AFP及AFU有利于臨床提高肝癌的診斷率，并有效的減少單項檢測的偏差，由于檢測技術(shù)的成熟及便利，值得在臨床工作中推廣。

［1］ Liu X，Wan X，Li Z，et al.Golgi protein 73(GP73)，a useful serum marker in liver diseases［J］.Clin Chem Lab Med，2011，49(8):1311－1316.

［2］ 朱月蓉，邱 紅，王 冰，等.ADA、5’-NT、TRF、TBA、LAP和PA在肝病診斷中的臨床評價［J］.安徽醫(yī)藥，2011，15(6):728－730.

［3］ 中華醫(yī)學會肝病學分會，中華醫(yī)學會感染病學分會.慢性乙型肝炎防治指南(2010年版)［J］.中華肝臟病雜志，2011，19(1):13－24.

［4］ Kim H，Kim K，Yu SJ，et al.Development of biomarkers for screening hepatocellular carcinoma using global data mining and multiple reaction monitoring［J］.PLoS One，2013，8(5):e63468.

［5］ Ba MC，Long H，Tang YQ，et al.GP73 expression and its significance in the diagnosis of hepatocellular carcinoma:a review［J］.Int J Clin Exp Pathol，2012，5(9):874 －881.

［6］ Hann HW，Wang M，Hafner J，et al.Analysis of GP73 in patients with HCC as a function of anti-cancer treatment［J］.Cancer Biomark，2010，7(6):269 －273.

［7］ Subwongcharoen S，Leelawat K，Treepongkaruna SA，et al.Serum AFP and AFP-L3 in clinically distinguished hepatocellular carcinoma from patients with liver masses［J］.J Med Assoc Thai，2011，94(Suppl 2):S46－51.

［8］ Kobayashi M，Hosaka T，Ikeda K，et al.Highly sensitive AFP-L3%assay is useful for predicting recurrence of hepatocellular carcinoma after curative treatment pre-and postoperatively［J］.Hepatol Res，2011，41(11):1036 －1045.

［9］ 黃麗君，眺正國.α-L-巖藻糖苷酶的研究進展［J］.檢驗醫(yī)學與臨床，2012，9(15):1920 －1921.

［10］ Fawzy Montaser M，Amin Sakr M，Omar Khalifa，et al.Alpha-L-fucosidase as a tumour marker of hepatocellular carcinoma［J］.Arab J Gastroenterol，2012，13(1):9 － 13.

［11］ Zhu J，Jiang F，Ni HB，et al.Combined analysis of serum γ-glutamyl transferase isoenzyme II，α-L-fucosidase and α-fetoprotein detected using a commercial kit in the diagnosis of hepatocellular carcinoma［J］.Exp Ther Med，2013，5(1):89 －94.

［12］ Malaguarnera G，Giordano M，Paladina I，et al.Serum markers of hepatocellular carcinoma［J］.Dig Dis Sci，2010，55(10):2744 －2755.