馬建梅，陳 承，黃 偉(.西安醫(yī)學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)院，陜西西安 700;.陜西省西安市第一醫(yī)院，陜西 西安 7000)

在我國，肺癌年發(fā)病率為35/100 000，成為我國的第一大癌癥［1］，危害極大。但目前肺癌的發(fā)生發(fā)展機(jī)制尚不明確，研究表明，腫瘤細(xì)胞凋亡抑制可能是肺癌發(fā)生、發(fā)展的關(guān)鍵。survivin是細(xì)胞凋亡抑制蛋白家族的成員，主要表達(dá)于發(fā)育中的胚胎組織，在許多惡性腫瘤組織高表達(dá)，但在分化成熟的組織中一般不表達(dá)［2］。本研究通過檢測肺癌、癌旁組織、良性病變中survivin表達(dá)，探討survivin及其亞細(xì)胞定位表達(dá)與肺癌發(fā)生、發(fā)展、預(yù)后的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 臨床資料 西安交通大學(xué)第二醫(yī)院、西安醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院2008年5月—2011年5月手術(shù)獲得的肺癌標(biāo)本60例，其中年齡52～76歲，平均65.5歲;腫瘤最大徑 2～9 cm，平均7 cm;鱗癌32例，腺癌28例;高分化癌16例，中分化癌25例，低分化癌19例;有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移29例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移31例;腫瘤分期 I期 26例，Ⅱ期21例，III期13例;患者既往均無腫瘤病史，術(shù)前均未行包括放、化療在內(nèi)的各種抗腫瘤治療。癌旁組織15例，均為距離腫瘤≤2 cm的組織，良性病變10例，包括結(jié)核病變6例，炎性病變4例，正常肺組織5例。肺癌患者手術(shù)后均進(jìn)行了隨訪，隨訪率100%，隨訪起始時(shí)間為手術(shù)治療開始日起，觀察終止時(shí)間為2012年12月31日。

1.2 主要試劑 兔抗人survivin單克隆抗體，免疫組化 SP試劑盒，DAB顯色試劑盒均購自武漢博士德生物工程有限公司。

1.3 survivin的檢測 石蠟包埋組織做4 μm厚切片，脫蠟、水化，微波抗原修復(fù)，血清封閉;一抗4℃孵育過夜，生物素標(biāo)記的二抗室溫孵育30 min，滴加辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉素卵白素工作液30 min，DAB顯色5～10 min，蘇木精復(fù)染后脫水、透明、封片，光鏡下觀察。用 PBS代替一抗作為陰性對照，采用試劑盒內(nèi)提供的陽性切片作為陽性對照。

1.4 結(jié)果判定 兩名經(jīng)驗(yàn)豐富的病理科醫(yī)師閱片，免疫組化染色強(qiáng)度分為弱陽性、中等陽性、強(qiáng)陽性，分別計(jì)為1、2、3分;選取5個(gè)高倍鏡(×400)視野，每個(gè)視野計(jì)數(shù)100個(gè)腫瘤細(xì)胞中陽性染色的細(xì)胞數(shù)，分為五個(gè)等級計(jì)分:0分，＜5%;1分，5% ～25%;2分，26% ～50%;3分，51% ～ 75%;4分，≥75%;以染色強(qiáng)度分值與陽性細(xì)胞數(shù)分值的乘積作為每一例的積分，積分為0者為表達(dá)陰性，積分≥1者為陽性。survivin陽性染色為胞質(zhì)或胞核出現(xiàn)棕黃色顆粒。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，survivin及胞質(zhì)表達(dá)的相關(guān)數(shù)據(jù)采用χ2檢驗(yàn)，生存率計(jì)算采用Kaplan-Meier法，影響生存率單因素分析采用Logrank檢驗(yàn)，用Cox比例危險(xiǎn)度模型作多因素預(yù)后分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

survivin陽性染色主要位于細(xì)胞質(zhì)，部分位于胞核，部分胞質(zhì)和胞核均出現(xiàn)表達(dá)。見圖1。

2.1 survivin在肺癌、癌旁組織、良性病變、正常組織的表達(dá) 60例肺癌中survivin陽性率為81.6%(49/60)，15例癌旁組織為survivin陽性率為13.3%(2/15)，10例良性病變survivin陽性率為0(0/10)，5例正常組織survivin陽性率為0(0/5)，進(jìn)行 χ2檢驗(yàn)，χ2=22.7，P ＜0.05，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，故survivin表達(dá)在肺癌組織高表達(dá)，癌旁組織低表達(dá)，良性病變及正常組織不表達(dá)。

2.2 survivin胞質(zhì)表達(dá)與肺癌的關(guān)系 49例survivin表達(dá)陽性的肺癌組織中胞質(zhì)陽性占69.4%(34/49)，胞核陽性為14.3%(7/49)，胞核胞質(zhì)均陽性16.3%(8/49)(將胞核表達(dá)與胞核胞質(zhì)均表達(dá)認(rèn)為非單純胞質(zhì)表達(dá)，本文簡稱“陰性”)，胞質(zhì)表達(dá)與肺癌特征的關(guān)系見表1。

2.3 survivin胞質(zhì)表達(dá)與肺癌患者生存率的關(guān)系 隨訪結(jié)果顯示:34例胞質(zhì)表達(dá)陽性的肺癌患者中死亡20例，失訪或存活14例，中位生存時(shí)間(26±5.64)個(gè)月、生存率41.18%;15例胞質(zhì)表達(dá)陰性的患者中死亡10例，失訪和存活5例，其中位生存時(shí)間(13±4.08)個(gè)月、生存率33.33%;Kaplan-Meier生存分析顯示肺癌survivin胞質(zhì)表達(dá)陰性患者的生存率低于胞質(zhì)表達(dá)陽性者，log-rank檢驗(yàn)χ2值=4.47，P=0.0346(P ＜0.05)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表2，圖2。

2.4 肺癌患者預(yù)后的多因素分析 分析肺癌預(yù)后的單因素相關(guān)因子，結(jié)果顯示:其與survivin胞質(zhì)陽性表達(dá)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，分期有關(guān)，多因素Cox回歸分析結(jié)果顯示:survivin胞質(zhì)表達(dá)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是反映肺癌預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，其危險(xiǎn)度分別為18.882、3.546，見表3。

表1 survivin胞質(zhì)表達(dá)與肺癌的關(guān)系

表2 Survivin胞質(zhì)表達(dá)在肺癌患者生存時(shí)間的比較

表3 肺癌預(yù)后多因素Cox分析

3 討論

survivin是1997年由耶魯大學(xué)的Ambzosini等用效應(yīng)蛋白酶受體-1(effector cell report-1，ERP-1)的cDNA在人類基因庫中篩選克隆出的基因。survivin基因定位于不穩(wěn)定性較高的染色體17q25上，由4個(gè)外顯子和3個(gè)內(nèi)含子組成，基因全長15Kb，編碼142個(gè)氨基酸的蛋白，表達(dá)于細(xì)胞周期的G2/M期，定位于細(xì)胞有絲分裂的紡錘體。survivin表達(dá)常見于胚胎發(fā)育過程，與細(xì)胞分裂和增殖密切相關(guān)，其表達(dá)有利于胚胎組織的內(nèi)穩(wěn)和分化［3］。survivin在成人組織的表達(dá)僅見于胸腺、睪丸、分泌期子宮內(nèi)膜，但其特異地高表達(dá)于惡性腫瘤中，研究發(fā)現(xiàn) 34.5%的胃癌，70.7%的乳腺癌，77.8%的膀胱癌，85.5%的非小細(xì)胞肺癌中都有不同程度的survivin mRNA表達(dá)。可見，survivin與腫瘤關(guān)系密切，那么，其與癌旁組織或良性病變有何關(guān)系?國外有學(xué)者發(fā)現(xiàn)胰腺癌細(xì)胞中的survivin表達(dá)率顯著高于胰腺良性腫瘤;國內(nèi)方艷秋［4］研究表明survivin在肝癌組織、癌旁組織及正常肝組織表達(dá)陽性率分別為76.67%，15%，0，本試驗(yàn)對比了60例肺癌組織、15例癌旁組織、10例良性病變、5例正常肺組織的survivin表達(dá)，發(fā)現(xiàn)survivin在肺癌高表達(dá)，癌旁組織低表達(dá)，良性病變、正常組織未見表達(dá);與相關(guān)報(bào)道相似，故推測survivin表達(dá)與腫瘤的發(fā)生有關(guān)，可作為一種新的腫瘤標(biāo)志物反映腫瘤的惡性程度。

近年研究發(fā)現(xiàn)survivin具有不同的剪切異構(gòu)體，不同的剪切異構(gòu)體有獨(dú)特的亞細(xì)胞定位和功能。免疫組化染色可以區(qū)分細(xì)胞中不同分布的survivin，而且只有細(xì)胞漿可以和P34結(jié)合，P34-cyclin B磷酸化survivin是 survivin發(fā)揮抑制凋亡作用所必須的［5］，細(xì)胞核內(nèi)的 survivin由于不能被 P34磷酸化，所以不能發(fā)揮凋亡抑制作用，從而可能會誘導(dǎo)凋亡，因此survivin亞細(xì)胞定位與腫瘤有密切的關(guān)系。李永平［6］報(bào)道:在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽性的乳腺癌原發(fā)灶組織中 survivin細(xì)胞漿內(nèi)表達(dá)陽性較細(xì)胞核內(nèi)表達(dá)陽性多;相對在未發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的原發(fā)灶中，survivin主要表達(dá)在細(xì)胞核，且二者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而survivin在乳腺癌亞細(xì)胞定位與其它臨床病理特征，如病理分級、雌激素受體表達(dá)情況或腫瘤大小，均無顯著關(guān)系;本研究發(fā)現(xiàn)60例肺癌標(biāo)本中，34例呈胞質(zhì)(漿)表達(dá)，胞質(zhì)(漿)表達(dá)與年齡、腫瘤大小、分期、分化、組織類型無關(guān)，與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，綜上所述，survivin胞質(zhì)表達(dá)陽性與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。國內(nèi)姚紅［7］報(bào)道侵襲轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致肺癌患者治療失敗和死亡的主要原因之一，因此，survivin胞質(zhì)表達(dá)和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的相關(guān)性與肺癌預(yù)后有關(guān)。林輝［8］報(bào)道:肝細(xì)胞癌中survivin胞質(zhì)表達(dá)陽性組的生存率明顯低于陰性組，且多因素Cox回歸分析提示survivin基因陽性表達(dá)是肝癌預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。Yao［9］在survivin與胃癌的研究中，發(fā)現(xiàn)survivin分布于胞核和胞漿(質(zhì))中，而且分析表明，核內(nèi)表達(dá)與較好預(yù)后有關(guān)，胞漿(質(zhì))陽性提示預(yù)后差;本試驗(yàn)檢測survivin主要在胞質(zhì)(漿)表達(dá)，對比胞質(zhì)(漿)表達(dá)陽性與陰性(非單純胞質(zhì)表達(dá)者)者生存率，陰性者生存率低于陽性者，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，因此推測survivin胞質(zhì)(漿)表達(dá)與肺癌預(yù)后有關(guān)，且進(jìn)行Cox多因素分析顯示:淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和survivin胞質(zhì)內(nèi)表達(dá)是肺癌預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。國內(nèi)吳志德［10］報(bào)道腫瘤標(biāo)志物可作為治療效果及復(fù)發(fā)監(jiān)測的指標(biāo)之一。survivin及其胞內(nèi)定位表達(dá)與肺癌治療效果的關(guān)系將是本試驗(yàn)進(jìn)一步深入研究的方向。

［1］ 黃東蘭，鄒建軍，張積仁，等.肺癌患病風(fēng)險(xiǎn)關(guān)鍵基因篩選［J］.中國腫瘤臨床，2012，29(23):1890 －1895.

［2］ Bayram S，Akkiz H，Bekar A，et al.The association between the survivin-31G/C promoter polymorphism and hepatocellular carcinoma risk in a Turkish population［J］.Cancer Epidemiol，2011，35(6):555－559.

［3］ Cho S，Lee JH，Cho SB，et al.Epigenetic methylation and expression of caspase 8 and survivin in hepatocellular carcinoma［J］.Pathol Int，2010，60(3):203 －211.

［4］ 方艷秋，白 曉，齊亞靈，等.肝癌及其癌旁組織中細(xì)胞凋亡抑制蛋白survivin的表達(dá)［J］.吉林大學(xué)學(xué)報(bào):醫(yī)學(xué)版，2013，39(1):47－50.

［5］ Yoon MJ，Park SS，Kang YJ，et al.Aurora B confers cancer cell resistance to TRAIL-induced apoptosis via phosphory lation of survivin［J］.Carcinogenesis，2012，33(3):492 －500.

［6］ 李永平，于 芳，呂勇剛，等.Survivin亞細(xì)胞定位與乳腺癌臨床病理特征關(guān)系的研究［J］.中國美容醫(yī)學(xué)，2012，21(5):785－787.

［7］ 姚 紅，陸友金，胡 昆.非小細(xì)胞肺癌中乙酰肝素酶蛋白的表達(dá)及臨床意義［J］.安徽醫(yī)藥，2010，14(6):666 －668.

［8］ 林 輝，何自力，鐘德玝.肝細(xì)胞癌survivin表達(dá)與臨床相關(guān)性［J］.世界華人消化雜志，2010，18(16):1676 －1681.

［9］ Yao C，Liu J，Shao L.Rapamycin inhibits the proliferation and apoptosis of gastric cancer cells by down regulating the expression of survivin［J］.Hepatogastroentrology，2011，58(107/108):1075 －1080.

［10］ 吳志德.腫瘤標(biāo)志物在肺癌聯(lián)合診斷的臨床應(yīng)用分析［J］.安徽醫(yī)藥，2013，17(5):793 －795.