錢力+陳華妮+勞玲玲+陸永旺+伍師書

摘要：研究了從野生酸荔枝（Litchi chinensis Sonn）核中提取多糖的最佳條件及其體外抗氧化活性。結果表明，最佳提取條件為提取溫度70 ℃，提取時間3.0 h，乙醇體積分數(shù)70%，在此條件下多糖的提取率為5.72%。體外試驗表明，酸荔枝核多糖對·OH具有明顯的清除作用。

關鍵詞：酸荔枝（Litchi chinensis Sonn）核;多糖;提取;抗氧化

中圖分類號：R284.2;S58 ? ? ? ?文獻標識碼：A ? ? ? ?文章編號：0439-8114（2014）20-4949-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2014.20.047

Extracting Polysaccharides from Seeds of Wild Acid Litchi and Its Antioxidant Activity

QIAN Li1，CHEN Hua-ni2， LAO Ling-ling1， LU Yong-wang1， WU Shi-shu1

（1.Baise University， Baise 533000，Guangxi，China ;2. Youjiang Medical College for Nationalities， Baise 533000， Guangxi，China）

Abstract： The optimal conditions of extracting polysaccharides from seeds of wild acid litchi and its antioxidant activity in vitro were investigated. The optimal conditions were extraction temperature of 90 ℃， extracttion time of 180 min and the ethanol concentration of 70% vol. Results showed that the polysaccharides from seeds of wild acid litchi had good scavenging effect and reduction power against ·OH.

Key words： ?acid Litchi seeds; polysaccharide; extraction; antioxidation

荔枝（Litchi chinensis Sonn）核為無患子科植物的干燥種子，主產(chǎn)于廣東、廣西等地，具有行血散結、祛寒止痛之功效。研究表明荔枝核具有調(diào)節(jié)血脂、降低血糖、抗氧化能力等藥理作用[1-3]。多糖廣泛存在于動物、植物和微生物中，是構成生命的四大基本物質(zhì)之一，它廣泛參與了細胞的各種生命現(xiàn)象及生理過程的調(diào)節(jié)，如免疫細胞間信息的傳遞與感受，細胞的轉化，分裂及再生等活動。多糖具有多種生物活性，同維持生物機能密切相關。因此多糖的研究在醫(yī)學領域受到越來越廣泛的重視[4-9]。廣西野生酸荔枝果實小、核大、肉薄，生長處于野生狀態(tài)，管理粗放。對酸荔枝核中多糖的研究尚未見報道，因此對其相關特性開展研究有著重要的意義。

1 ?材料與方法

1.1 ?材料與儀器

原料為廣西靖西深山采摘的野生酸荔枝（采集的樣品經(jīng)右江民族醫(yī)學院張數(shù)球教授鑒定確認）。將酸荔枝的核取出，洗凈、干燥、粉碎后備用。主要試劑葡萄糖，鹽酸，無水乙醇，硫酸，苯酚，過氧化氫，十二水合硫酸鐵銨，水楊酸，氯仿，正丁醇等為分析純。

儀器旋轉蒸發(fā)器（RE-3000，上海亞榮生化儀器廠），數(shù)顯恒溫水浴鍋（HH6，國華電器有限公司），循環(huán)水式真空泵（SHZ-D，鞏義市予華儀器有限公司），紫外-可見分光光度計（TU-1810，北京普析通用儀器有限責任公司），分析天平（CPA64，賽多利斯科學儀器北京有限公司），磁力攪拌器（S21-1，金壇市醫(yī)療儀器廠）。

1.2 ?方法

1.2.1 ?標準曲線的繪制 ?依次稱取葡萄糖標準品50、100、200、300、350 mg，置于500 mL容量瓶中加蒸餾水定容，分別稀釋成10、20、40、60、70 μg /mL的5個不同濃度的標準品系列溶液。再分別精確量取1.00 mL樣品液5份，置于25 mL的比色管中。加1.50 mL 5.0%苯酚溶液，再加7.50 mL濃硫酸，混勻后放置20 min[10，11]。用紫外分光光度計在490 nm波長處測定其吸光度。以標準品濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標繪制標準曲線，建立回歸方程。

1.2.2 ?酸荔枝核多糖的提取與純化 ?稱取酸荔枝核粉10 g，設置單因素試驗，考察提取時間、提取溫度、乙醇體積分數(shù)對多糖提取率的影響。各因素水平設置如下：①提取時間：2.0、2.5、3.0、3.5、4.0 h;②提取溫度：40、50、60、70、80 ℃;③乙醇體積分數(shù)：50%、60%、70%、80%、90%?；亓鹘Y束后過濾，濾液用旋轉蒸發(fā)儀濃縮至一定體積，再分別用氯仿，乙酸乙酯萃取后，即得酸荔枝核多糖粗品。以多糖粗品的提取率為評價指標，選出最佳提取條件。

將所得的酸荔枝核多糖粗品放在錐形瓶中，加入適量的活性炭，混勻后，靜置過夜，得脫色后的酸荔枝核多糖粗品。加入體積為前一步驟所得的多糖水溶液體積1/4的氯仿，再加入體積為氯仿體積1/4的正丁醇，將混合物劇烈震蕩20～30 min，通過分液漏斗除去水層和溶劑層之間的變性蛋白，如此重復3次，將蛋白質(zhì)除去，即得到多糖樣品。將得到多糖樣品置于150 mL錐形瓶中，加入1 mol/L的硫酸2.00 mL。充分搖勻后放入沸水浴2 h。冷卻后，再將水解液轉入100 mL的容量瓶并加去離子水定容至刻度。分別精確量取樣品液40 μL 5份，分別置于25 mL比色管，以去離子水補充至2.0 mL加1.5 mL 5.0%苯酚溶液，再加7.5 mL濃硫酸，混均后放置20 min。用紫外分光光度計于490 nm處，測其吸光度，由回歸方程計算酸荔枝核多糖的含量。

1.2.3 ?酸荔枝核多糖對·OH的清除效果 ?參照Fenton反應法產(chǎn)生·OH自由基[12]。H2O2/Fe2+體系可通過Fenton反應產(chǎn)生自由基，化學反應為：H2O2+Fe2+→·OH+ OH- +Fe2+。用·OH氧化水楊酸產(chǎn)生有色物質(zhì)，該產(chǎn)物在510 nm波長有強吸收峰，若體系中加入·OH清除的物質(zhì)，就會減少有色物質(zhì)的產(chǎn)生，吸收度降低。吸光度越低，清除·OH效果越好。

取5支試管并依次編號，每支各加9 mmol/L的FeSO4 100 μL，9mol/L水楊酸-乙醇溶液100 μL，按試管編號各加不同濃度的酸荔枝核多糖溶液，并用去離子水加至2 mL，最后加入8.80 mmol/L的H2O2 100 μL啟動反應，在室溫下反應1 h，并與空白液比較，于510 nm處測其吸光度，計算其清除率，得到被測物對·OH的清除效果。

清除率=[（A0-As）/A0]×100%

式中，A0為空白對照液的吸光度;As為加入酸荔枝核多糖提取液處理的吸光度。

2 ?結果與分析

2.1 ?標準曲線

繪制得到的標準曲線見圖1，回歸方程為A=0.006 87C+0.016 83，R2=0.999 2，說明在所取濃度范圍內(nèi)，葡萄糖溶液濃度和吸光度呈良好的線性關系。

2.2 ?酸荔枝核中多糖提取的結果

2.2.1 ?提取時間對提取率的影響 ?提取時間對酸荔枝核多糖提取率的影響結果見圖2。由圖2可知，隨著提取時間的延長，酸荔枝核多糖提取率先上升然后下降?？赡苁怯捎跁r間過長導致雜質(zhì)過多。加熱時間過長也可能使多糖分解。故最佳提取時間為3.0 h。

2.2.2 ?提取溫度對提取率的影響 ?溫度對酸荔枝核多糖提取率的影響結果見圖3。由圖3可見，回流溫度低于70 ℃時，提取率隨溫度的升高而升高，溫度高于70 ℃時提取率有所下降。可能是是由于過高的溫度導致多糖的降解，從而不利于提高提取率，故最佳提取溫度為70 ℃。

2.2.3 ?乙醇體積分數(shù)對提取率的影響 ?酸荔枝核多糖提取率隨乙醇體積分數(shù)變化的結果見圖4。由圖4可知，多糖提取率隨乙醇體積分數(shù)的升高呈先上升后下降的趨勢。乙醇體積分數(shù)為70%時，提取率最大。乙醇體積分數(shù)過高，可能會使多糖的溶出變得困難，不利于提取，故乙醇的最佳體積分數(shù)為70%。

根據(jù)單因素試驗結果，在最優(yōu)試驗條件下，取100 g酸荔枝核過40目篩的細粉，按照“1.2.2”的方法分別用移液器量取40、40、40、400、400、400 μL樣品液6份，測定樣品的吸光度，根據(jù)回歸方程計算荔枝核多糖的平均提取率為5.72%，RSD為2.494%。

2.3 ?酸荔枝核多糖對·OH的清除作用

酸荔枝核多糖對·OH的清除結果見圖5。從圖5可以看出，·OH的清除率隨體系中酸荔枝核多糖濃度的增加而上升。提取的酸荔枝核多糖對·OH有一定的清除作用，濃度為0.4 g/L時，對·OH的清除率達到70%。

3 ?結論

試驗以野生酸荔枝核為原料，考察了各因素對多糖提取率的影響。通過單因素試驗確定了酸荔枝核多糖的最佳提取工藝為提取溫度70 ℃，提取時間3.0 h，乙醇體積分數(shù)70%，此條件下多糖提取率為5.72%。體外試驗表明，酸荔枝核多糖對·OH具有明顯的清除作用，為進一步開發(fā)酸荔枝的藥用價值提供科學依據(jù)。

參考文獻：

[1] 陸永旺，勞玲玲，陳華妮，等.酸荔枝核黃酮體外抗氧化作用的研究[J].中國釀造，2013，32（7）：104-106.

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[3] 袁 ?紅.荔枝核多糖提取物對四氧嘧啶致糖尿病小鼠降糖作用[J].健康研究，2010，30（4）：252-255.

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[6] 黃鳳香，廖 ?迎，曾建紅，等.廣西莪術多糖水提工藝優(yōu)化及不同產(chǎn)地多糖含量測定[J].湖北農(nóng)業(yè)科學，2013，52（16）：3947-3950.

[7] 董海麗，劉 ?紅.濕法超微粉碎提取石斛多糖的研究[J].北方園藝，2013，（15）：150-152.

[8] 左紹遠，錢金栿.紅花蜂花粉多糖提取工藝的優(yōu)化及其抗氧化性質(zhì)研究[J].湖北農(nóng)業(yè)科學，2013，52（7）：1631-1633.

[9] 靳學遠，劉 ?紅，秦 ?霞.超聲波輔助提取壺瓶棗多糖工藝優(yōu)化[J].湖北農(nóng)業(yè)科學，2013，52（14）：3386-3387.

[10] 張惟杰.復合多糖生化研究技術[M].杭州：浙江大學出版社， 1999.

[11] 崔紅華，李超英，張大方，等.用苯酚-硫酸法測定人參多糖含量的研究[J].中國中醫(yī)藥信息雜志，1999，6（2）：24-26.

[12] 袁建梅，呂馨馨，王春峰.合歡花多糖的提取工藝及其抗氧化活性研究[J].湖北農(nóng)業(yè)科學，2013，52（11）：2625-2628.

1.2.3 ?酸荔枝核多糖對·OH的清除效果 ?參照Fenton反應法產(chǎn)生·OH自由基[12]。H2O2/Fe2+體系可通過Fenton反應產(chǎn)生自由基，化學反應為：H2O2+Fe2+→·OH+ OH- +Fe2+。用·OH氧化水楊酸產(chǎn)生有色物質(zhì)，該產(chǎn)物在510 nm波長有強吸收峰，若體系中加入·OH清除的物質(zhì)，就會減少有色物質(zhì)的產(chǎn)生，吸收度降低。吸光度越低，清除·OH效果越好。

取5支試管并依次編號，每支各加9 mmol/L的FeSO4 100 μL，9mol/L水楊酸-乙醇溶液100 μL，按試管編號各加不同濃度的酸荔枝核多糖溶液，并用去離子水加至2 mL，最后加入8.80 mmol/L的H2O2 100 μL啟動反應，在室溫下反應1 h，并與空白液比較，于510 nm處測其吸光度，計算其清除率，得到被測物對·OH的清除效果。

清除率=[（A0-As）/A0]×100%

式中，A0為空白對照液的吸光度;As為加入酸荔枝核多糖提取液處理的吸光度。

2 ?結果與分析

2.1 ?標準曲線

繪制得到的標準曲線見圖1，回歸方程為A=0.006 87C+0.016 83，R2=0.999 2，說明在所取濃度范圍內(nèi)，葡萄糖溶液濃度和吸光度呈良好的線性關系。

2.2 ?酸荔枝核中多糖提取的結果

2.2.1 ?提取時間對提取率的影響 ?提取時間對酸荔枝核多糖提取率的影響結果見圖2。由圖2可知，隨著提取時間的延長，酸荔枝核多糖提取率先上升然后下降?？赡苁怯捎跁r間過長導致雜質(zhì)過多。加熱時間過長也可能使多糖分解。故最佳提取時間為3.0 h。

2.2.2 ?提取溫度對提取率的影響 ?溫度對酸荔枝核多糖提取率的影響結果見圖3。由圖3可見，回流溫度低于70 ℃時，提取率隨溫度的升高而升高，溫度高于70 ℃時提取率有所下降?？赡苁鞘怯捎谶^高的溫度導致多糖的降解，從而不利于提高提取率，故最佳提取溫度為70 ℃。

2.2.3 ?乙醇體積分數(shù)對提取率的影響 ?酸荔枝核多糖提取率隨乙醇體積分數(shù)變化的結果見圖4。由圖4可知，多糖提取率隨乙醇體積分數(shù)的升高呈先上升后下降的趨勢。乙醇體積分數(shù)為70%時，提取率最大。乙醇體積分數(shù)過高，可能會使多糖的溶出變得困難，不利于提取，故乙醇的最佳體積分數(shù)為70%。

根據(jù)單因素試驗結果，在最優(yōu)試驗條件下，取100 g酸荔枝核過40目篩的細粉，按照“1.2.2”的方法分別用移液器量取40、40、40、400、400、400 μL樣品液6份，測定樣品的吸光度，根據(jù)回歸方程計算荔枝核多糖的平均提取率為5.72%，RSD為2.494%。

2.3 ?酸荔枝核多糖對·OH的清除作用

酸荔枝核多糖對·OH的清除結果見圖5。從圖5可以看出，·OH的清除率隨體系中酸荔枝核多糖濃度的增加而上升。提取的酸荔枝核多糖對·OH有一定的清除作用，濃度為0.4 g/L時，對·OH的清除率達到70%。

3 ?結論

試驗以野生酸荔枝核為原料，考察了各因素對多糖提取率的影響。通過單因素試驗確定了酸荔枝核多糖的最佳提取工藝為提取溫度70 ℃，提取時間3.0 h，乙醇體積分數(shù)70%，此條件下多糖提取率為5.72%。體外試驗表明，酸荔枝核多糖對·OH具有明顯的清除作用，為進一步開發(fā)酸荔枝的藥用價值提供科學依據(jù)。

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[9] 靳學遠，劉 ?紅，秦 ?霞.超聲波輔助提取壺瓶棗多糖工藝優(yōu)化[J].湖北農(nóng)業(yè)科學，2013，52（14）：3386-3387.

[10] 張惟杰.復合多糖生化研究技術[M].杭州：浙江大學出版社， 1999.

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[12] 袁建梅，呂馨馨，王春峰.合歡花多糖的提取工藝及其抗氧化活性研究[J].湖北農(nóng)業(yè)科學，2013，52（11）：2625-2628.

1.2.3 ?酸荔枝核多糖對·OH的清除效果 ?參照Fenton反應法產(chǎn)生·OH自由基[12]。H2O2/Fe2+體系可通過Fenton反應產(chǎn)生自由基，化學反應為：H2O2+Fe2+→·OH+ OH- +Fe2+。用·OH氧化水楊酸產(chǎn)生有色物質(zhì)，該產(chǎn)物在510 nm波長有強吸收峰，若體系中加入·OH清除的物質(zhì)，就會減少有色物質(zhì)的產(chǎn)生，吸收度降低。吸光度越低，清除·OH效果越好。

取5支試管并依次編號，每支各加9 mmol/L的FeSO4 100 μL，9mol/L水楊酸-乙醇溶液100 μL，按試管編號各加不同濃度的酸荔枝核多糖溶液，并用去離子水加至2 mL，最后加入8.80 mmol/L的H2O2 100 μL啟動反應，在室溫下反應1 h，并與空白液比較，于510 nm處測其吸光度，計算其清除率，得到被測物對·OH的清除效果。

清除率=[（A0-As）/A0]×100%

式中，A0為空白對照液的吸光度;As為加入酸荔枝核多糖提取液處理的吸光度。

2 ?結果與分析

2.1 ?標準曲線

繪制得到的標準曲線見圖1，回歸方程為A=0.006 87C+0.016 83，R2=0.999 2，說明在所取濃度范圍內(nèi)，葡萄糖溶液濃度和吸光度呈良好的線性關系。

2.2 ?酸荔枝核中多糖提取的結果

2.2.1 ?提取時間對提取率的影響 ?提取時間對酸荔枝核多糖提取率的影響結果見圖2。由圖2可知，隨著提取時間的延長，酸荔枝核多糖提取率先上升然后下降?？赡苁怯捎跁r間過長導致雜質(zhì)過多。加熱時間過長也可能使多糖分解。故最佳提取時間為3.0 h。

2.2.2 ?提取溫度對提取率的影響 ?溫度對酸荔枝核多糖提取率的影響結果見圖3。由圖3可見，回流溫度低于70 ℃時，提取率隨溫度的升高而升高，溫度高于70 ℃時提取率有所下降?？赡苁鞘怯捎谶^高的溫度導致多糖的降解，從而不利于提高提取率，故最佳提取溫度為70 ℃。

2.2.3 ?乙醇體積分數(shù)對提取率的影響 ?酸荔枝核多糖提取率隨乙醇體積分數(shù)變化的結果見圖4。由圖4可知，多糖提取率隨乙醇體積分數(shù)的升高呈先上升后下降的趨勢。乙醇體積分數(shù)為70%時，提取率最大。乙醇體積分數(shù)過高，可能會使多糖的溶出變得困難，不利于提取，故乙醇的最佳體積分數(shù)為70%。

根據(jù)單因素試驗結果，在最優(yōu)試驗條件下，取100 g酸荔枝核過40目篩的細粉，按照“1.2.2”的方法分別用移液器量取40、40、40、400、400、400 μL樣品液6份，測定樣品的吸光度，根據(jù)回歸方程計算荔枝核多糖的平均提取率為5.72%，RSD為2.494%。

2.3 ?酸荔枝核多糖對·OH的清除作用

酸荔枝核多糖對·OH的清除結果見圖5。從圖5可以看出，·OH的清除率隨體系中酸荔枝核多糖濃度的增加而上升。提取的酸荔枝核多糖對·OH有一定的清除作用，濃度為0.4 g/L時，對·OH的清除率達到70%。

3 ?結論

試驗以野生酸荔枝核為原料，考察了各因素對多糖提取率的影響。通過單因素試驗確定了酸荔枝核多糖的最佳提取工藝為提取溫度70 ℃，提取時間3.0 h，乙醇體積分數(shù)70%，此條件下多糖提取率為5.72%。體外試驗表明，酸荔枝核多糖對·OH具有明顯的清除作用，為進一步開發(fā)酸荔枝的藥用價值提供科學依據(jù)。

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