何剛偉

(西南科技大學信息工程學院,四川綿陽 621010)

三維熒光光譜法識別魚毒性藻類的可行性研究

何剛偉

(西南科技大學信息工程學院,四川綿陽 621010)

提出了快速識別分析藻類的熒光檢測的方法——三維熒光光譜法,以典型的無毒和魚毒性藻類為研究對象,實驗驗證了三維熒光光譜法識別分析魚毒性藻類的可行性。采用日立F-4600熒光分光光度計對典型藻類進行譜圖測量,研究結果表明:無毒性藻類和魚毒性藻類的三維譜圖形狀有較大差異,三維熒光光譜法識別分析魚毒性藻類是可行的。該技術可以在不需要對樣品進行復雜預處理的條件下進行測試,這對實現海洋藻類實時、在線、現場測量具有重要的意義。

三維熒光光譜法 快速檢測 魚毒性藻類 識別分析

近年來，魚毒性赤潮災害頻發(fā)，對海產養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的經濟損失，影響我國近岸養(yǎng)殖業(yè)持續(xù)穩(wěn)定的發(fā)展。魚毒性藻類是引發(fā)魚毒性赤潮的一類有毒海藻，它能產生對魚類毒性極強的溶血毒素，這種毒素是大多數有毒藻類產生的一類毒素。它可在短時間內造成大量養(yǎng)殖魚類死亡[1-4]。但此類赤潮毒素尚無對人類造成危害的報道。如海洋卡盾藻(C.marina)等可以產生溶血性毒素及其他可導致魚類死亡的魚毒素。目前對魚毒性藻類的識別檢測大體上可以劃分為基于形態(tài)學差異的圖像識別技術、基于核酸分析的檢測方法、基于免疫分析的檢測方法、基于化學生物標志物(如色素) 的方法和基于光學特性的方法等幾個方面并沒有一種快速準確的技術[5]，傳統(tǒng)的藻細胞顯微觀察費時費力，不能有效達到識別效果。

三維熒光技術作為近年來快速發(fā)展的新型化學分析手段，具有靈敏度高、選擇性強、樣品所需前處理簡單、測定速度快、測定成本低、易于自動化等優(yōu)點適用于大量浮游藻類樣品的快速分析，也適用于現場的實時監(jiān)測[6]。本文探討了三維熒光光譜法識別魚毒性藻類的可行性。該研究對有效開展赤潮災害的應急管理、提高養(yǎng)殖業(yè)經濟效益，促進經濟發(fā)展具有十分重要的意義。

圖1 Dn-EX

圖2 Dn-EM

1 實驗部分

1.1 儀器和分析條件

采用日立F-4600熒光分光光度計。

儀器參數：光譜帶寬：激發(fā)：1.0，2.5，5.0，10.0nm發(fā)射：1.0，2.5，5.0，10.0，20.0nm；響應時間：可達40ms；光源：150w Xe燈，高強度的光源為200-900nm波長范圍內的測定提供充足的光能；監(jiān)視器：光電管；檢測器：光電倍增管。

1.2 試劑和樣品處理

將各個藻種用符號標記，如D1代表海洋卡盾藻，以此方便后面曲線的繪制。各個符號與藻種的對應關系如表1、表2所示。

圖3 Wn-EX

圖4 Wn-EM

藻種均取自暨南大學赤潮與海洋生物學研究中心藻種室。將自然海水使用0.45μm微孔濾膜過濾于錐形瓶中，121℃、15psi下滅菌25min，冷卻到室溫。用f/2改良配方配制培養(yǎng)液，接種藻液后置于人工氣候箱中培養(yǎng)。溫度25℃，光照強度60μmol m-2s-1，光暗循環(huán)L：D＝12：12。每組設三個平行樣，以一個平行樣為訓練集，另兩個平行樣為測試集。每天固定時間取樣于顯微鏡下用0.1mL浮游植物計數框進行藻細胞計數，繪制生長曲線，確定藻類的生長期。

圖5 Dn+Wn-EM

圖6 Dn+Wn-EX

表1 魚毒性藻種Table.1 ichthyotoxic microalgae species

表2 無毒性藻種Table.2 non-toxic microalgae species

2 二維熒光光譜對比與結論

以下圖1到圖6為各個藻種的2維熒光光譜對比圖，縱軸是熒光相對強度，橫軸是激發(fā)或者發(fā)射波長。其中圖例下面的EM指的是激發(fā)光譜，EX指的是發(fā)射光譜。為了圖文展現的直觀性，每兩幅圖后面附上對比結論。

(1) 四種魚毒性藻類的激發(fā)譜圖如圖1所示，其激發(fā)譜圖形狀及其特征激發(fā)基本一致。

(2) 四種魚毒性藻類的激發(fā)譜圖如圖2所示，其發(fā)射譜圖形狀及其特征發(fā)射基本一致。

(3) 不能通過二維光譜數據對魚毒性藻類進行區(qū)分。

(4) 四種無毒性藻類的激發(fā)譜圖如圖3所示，其激發(fā)譜圖形狀及其特征激發(fā)基本一致。

(5) 四種無毒性藻類的激發(fā)譜圖如圖4所示，其發(fā)射譜圖形狀及其特征發(fā)射基本一致。

(6)不能通過二維光譜數據對無毒性藻類進行區(qū)分。

(7) 四種魚毒性藻類和4種無毒性藻類的發(fā)射譜圖如圖5所示，其激發(fā)譜圖形狀及其特征激發(fā)基本一致。

(8)四種魚毒性藻類和4種無毒性藻類的激發(fā)譜圖如圖6所示，其發(fā)射譜圖形狀及其特征發(fā)射基本一致。

(9)不能通過二維光譜數據對魚毒性藻類和無毒性藻類進行區(qū)分。

圖7 D1-3D

圖8 D2-3D

圖9 D3-3D

圖10 D4-3D

圖11 W1-3D

圖12 W2-3D

圖13 W3-3D

圖14 W4-3D

3 三維熒光光譜對比與結論

以下圖7到圖14為所選取的8種藻類(4種為無毒性，4種為魚毒性)的三維熒光光譜圖，橫軸和縱軸分別為激發(fā)和發(fā)射波長，豎軸為相對熒光強度。圖例中的3D代表三維譜圖，其中圖7到圖10為魚毒性藻類，圖11到圖14為無毒性藻類。對比結論附于圖后。

圖7到圖10四種魚毒性藻類的三維圖譜形狀基本上一致，都是在激發(fā)波長660nm-680nm，發(fā)射波長500nm-540nm之間存在一個突出的熒光峰。而圖11到圖14的四種無毒性藻類形狀則明顯不同。圖11在激發(fā)波長700nm-720nm，發(fā)射波長400nm-500nm存在熒光峰，圖12在激發(fā)波長720nm-740nm，發(fā)射波長440nm-460nm存在一個低的熒光峰。圖13在激發(fā)波長700nm-720nm，發(fā)射波長400nm-460nm存在低的熒光峰。圖14熒光峰的位置位于激發(fā)波長700nm-720nm，發(fā)射波長440nm-460nm。

從三維圖直觀來看，無毒性藻類與魚毒性藻類的三維譜圖在形狀上相差較大，因此結合譜圖峰值位置數據的差異性與譜圖形狀的區(qū)別性完全可以達到識別的效果，實現三維熒光法對魚毒性藻類的識別分析。

4 結論和展望

通過以上熒光譜圖對比發(fā)現，無毒藻類和魚毒性藻類的二維譜圖沒有明顯差別，然而其三維譜圖在形狀上相差較大，這說明通過三維熒光光譜技術對魚毒性藻類的識別分析是可行性的?；盖辶热死眯〔ǚ治龇ń⒘俗R別魚毒性藻類的數學模型，為藻類定量分析提供了便利[7，8]，隨著激光技術、探測器技術以及化學計量學的發(fā)展，三維熒光光譜技術能夠在未知條件下進行各待測物定性定量分析，可用于藻類的現場檢測，也可推廣到其他實際環(huán)境中物種識別分析。

致謝：在此對暨南大學能夠提供藻種和實驗條件謹致謝意！

[1]Ling C,Trick C G,Harmful Algae,2010,9(5):522.

[2]江天久,佟蒙蒙,齊雨藻.赤潮的分類分級標準及預警色設置[J].生態(tài)學報,2006,26(6):2035-2040.

[3]José-Luis Giner,Hui Zhao, Carmelo Tomas.Sterols and fatty acids of three harmful algae previously assigned as Chattonella[J].Phytochemistry,2008,69:2167-2171.

[4]桓清柳.具溶血活性的魚毒性藻類的三維熒光光譜識別研究[D].暨南大學,2013.

[5]于志剛,米鐵柱,姚鵬,甄毓.赤潮藻鑒定與定量檢測方法進展[J].中國海洋大學學報,2009,39(5):1067-1076.

[6]陳國珍,黃賢智.熒光分析法[M].北京:科學出版社,第二版,1990:23-94.

[7]桓清柳,黃翔,吳霓,江濤,江天久.魚毒性藻類及其溶血活性的三維熒光光譜識別研究[J].光譜學與光譜分析,2013,33(2):399-403.

[8]Zhang F,Su RG,HEJF.Phycological Society Of America,2010,46,403.

何剛偉(1990—),男,陜西咸陽人,西南科技大學信息工程學院碩士研究生,主要從事熒光檢測技術研究.