武艷++++++曹雅男++++++劉潔婷++++++袁曉環(huán)++++++騰云

[摘要] 間充質(zhì)干細(xì)胞是干細(xì)胞家族的重要成員，起源于中胚層和外胚層，因其具有易分離、趨化性、免疫調(diào)節(jié)作用、多向分化潛能等生物學(xué)特性而日益受到人們的關(guān)注，并成為細(xì)胞療法中治療各種難治性疾病的熱門種子細(xì)胞，然而細(xì)胞療法所涉及的潛在風(fēng)險(xiǎn)還不確定。本文就間充質(zhì)干細(xì)胞應(yīng)用所涉及的安全性問題作綜述，并強(qiáng)調(diào)建立規(guī)范化的應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)更有利于細(xì)胞產(chǎn)品在臨床上的應(yīng)用和推廣，給廣大患者帶來真正的福音。

[關(guān)鍵詞] 間充質(zhì)干細(xì)胞；細(xì)胞療法；安全性

[中圖分類號(hào)] R457.7 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1674-4721（2014）11（b）-0190-03

細(xì)胞療法近年來已成為治療多種疾病的新策略，其目的是替代修復(fù)或加強(qiáng)受損組織和器官的生物學(xué)功能。隨著干細(xì)胞生物學(xué)與再生醫(yī)學(xué)研究的深入，人們對(duì)于其生物學(xué)特性及潛在的臨床應(yīng)用認(rèn)識(shí)逐漸加深，使之成為細(xì)胞療法中應(yīng)用最多的靶細(xì)胞[1-3]。隨著對(duì)間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cells，MSCs）認(rèn)識(shí)的逐步深入，其自身的優(yōu)越性逐漸顯露出來，將成為細(xì)胞替代治療的理想種子細(xì)胞。對(duì)于MSCs研究的某些成果已開始應(yīng)用于臨床，有一些雖然暫時(shí)未能在臨床上開展，但也為有些疾病的臨床治療提供了新的治療角度和思路。對(duì)于MSCs治療作用的評(píng)估最開始是在再生醫(yī)學(xué)的應(yīng)用上，MSCs已經(jīng)顯示出具有直接調(diào)節(jié)先天性與適應(yīng)性免疫系統(tǒng)的作用[4]、促進(jìn)上皮細(xì)胞增殖[5]、促進(jìn)缺血性組織的血管再生等等[6]，MSCs的這些特性發(fā)現(xiàn)開啟了MSCs移植治療免疫性、組織損傷性等疾病的新紀(jì)元。

近年來，對(duì)一些難治性疾病采用MSCs移植治療已經(jīng)得到美國(guó)食品和藥物管理局（US-FDA）的批準(zhǔn)，包括心肌梗死、腦卒中、半月板損傷、移植物抗宿主病及自身免疫紊亂性疾病等[7]。盡管在過去的十幾年中，臨床試驗(yàn)很少發(fā)現(xiàn)MSCs移植會(huì)產(chǎn)生不利的影響，但在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)則發(fā)現(xiàn)可能存在較短時(shí)間內(nèi)未發(fā)現(xiàn)潛在性的危害，本文將MSCs移植涉及的安全性問題作總結(jié)。

MSCs移植方法的過程包括細(xì)胞的采集、分離、培養(yǎng)、純化以及細(xì)胞移植到患者體內(nèi)。臨床應(yīng)用干細(xì)胞治療疾病最重要的前提之一就是必須保證細(xì)胞產(chǎn)品的安全性、有效性和質(zhì)量可控性，其中質(zhì)量可控性是安全性和有效性的基礎(chǔ)和保證。那么，如何保證用于臨床的干細(xì)胞是安全、有效，并保證質(zhì)量可控呢？對(duì)于這些細(xì)胞的分離、培養(yǎng)、鑒定和移植有可靠的履行規(guī)則嗎？目前，在歐洲國(guó)家已經(jīng)開始提出使用臨床級(jí)的MSCs產(chǎn)品，并且開始制訂包括無菌、細(xì)胞活力和染色體表型等的各種質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)。細(xì)胞治療的過程非常復(fù)雜，有許多基本的生物學(xué)問題需要弄清楚。事實(shí)上，MSCs移植的應(yīng)用不僅面臨其他細(xì)胞療法共同的安全性問題，也面臨其所獨(dú)有的問題。

1 細(xì)胞的分離、培養(yǎng)和純化

雖然來源于骨髓比來源于其他組織的MSCs的數(shù)量相對(duì)更多，但MSCs的數(shù)量?jī)H占骨髓總量的0.001%～0.01%[8]，很難滿足臨床細(xì)胞治療的需要，因此需要培育大量的MSCs來滿足其應(yīng)用，但在MSCs的分離、培養(yǎng)、細(xì)胞增殖傳代的過程中有許多問題需要考慮。

干細(xì)胞組織來源多樣，供者的既往病史、家族史、性別、年齡、血型、組織相容性抗原等遺傳背景都需要考慮。在進(jìn)行自體移植收集細(xì)胞的時(shí)候，也需要對(duì)患者的整體狀況作評(píng)估。提取細(xì)胞的手術(shù)可能會(huì)損傷患有感染、腎臟疾病、心包積液等禁忌證患者的健康。對(duì)于細(xì)胞產(chǎn)品本身來說，確保其無菌狀態(tài)是細(xì)胞療法的一個(gè)首要問題，因?yàn)榧?xì)胞產(chǎn)品不能像其他藥品那樣有一個(gè)終端滅菌消毒的過程，因此全程操作必須在無菌條件下進(jìn)行[9]。在收集細(xì)胞之前，所有的腸道外用藥和醫(yī)療器械都需高溫消毒，一次性物品也要進(jìn)行消毒處理，并行有氧和厭氧菌及真菌微生物檢測(cè)，以保證細(xì)胞無菌且不會(huì)給患者帶來傷害。

另外，培養(yǎng)條件對(duì)于維持細(xì)胞的特性也非常重要。細(xì)胞的體外分離、培養(yǎng)、擴(kuò)增和細(xì)胞制品制備過程的漫長(zhǎng)且需要加入血清、抗生素、生長(zhǎng)因子、抗體、膠原酶、蛋白酶等物質(zhì)，外來物質(zhì)的污染也不可避免，在此過程中，以加入的血清為例，目前細(xì)胞培養(yǎng)的培養(yǎng)基需要加入10%～20%的胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS或fetal calf serum，F(xiàn)CS），雖然FBS或FCS似乎是獲得高質(zhì)量MSCs必不可少的，但其能帶來潛在的危險(xiǎn)，甚至在移植入患者體內(nèi)后引起免疫反應(yīng)[10-11]，包括傳播具有免疫原性的異種蛋白和致病原等[12]，而使MSCs移植的療效大大降低[13]。因此，在細(xì)胞培養(yǎng)過程中，尋找FBS/FCS的替代物或采用無血清培養(yǎng)，取消非人產(chǎn)品的使用來降低潛在的風(fēng)險(xiǎn)是有必要的[14]。Doucet等[15]已經(jīng)發(fā)現(xiàn)在體外培養(yǎng)MSCs時(shí)，采用血小板血漿培養(yǎng)細(xì)胞維持MSCs分化能力比FCS的效果更好。其他外來因素包括細(xì)菌、支原體、病毒等也會(huì)影響細(xì)胞產(chǎn)品的應(yīng)用。對(duì)于病毒來說，最主要的來源是供體的骨髓，因此對(duì)于供體的血清學(xué)檢測(cè)分析是否存在人類免疫缺陷病毒、人類T淋巴細(xì)胞病毒、肝炎病毒等非常必要[16]。另外還有一個(gè)重要的問題需要注意，許多病毒的潛伏期很長(zhǎng)，這也就意味著其潛在的風(fēng)險(xiǎn)在整個(gè)過程中無法完全消除。

在體外的操作過程中，細(xì)胞的特性包括生物學(xué)功能、端粒酶、核型、組織相容性抗原、原癌抑癌基因、增殖能力、分化潛能等可能發(fā)生改變并帶來免疫毒性和致瘤風(fēng)險(xiǎn)。細(xì)胞培養(yǎng)、保存、運(yùn)輸、復(fù)蘇、配制的過程時(shí)間較長(zhǎng)，細(xì)胞制品的存活率、生物學(xué)功能、均一性無時(shí)不在變化，難以保證MSCs臨床應(yīng)用的安全、有效，甚至在MSCs的早期傳代細(xì)胞也會(huì)發(fā)生染色體異常[17]，這就意味著在MSCs移植之前其特性應(yīng)被監(jiān)測(cè)以保證應(yīng)用的安全性。

2 細(xì)胞的貯存

一般來說，制備最終細(xì)胞產(chǎn)品在應(yīng)用之前都是冷藏貯存在細(xì)胞庫中。細(xì)胞產(chǎn)品的半衰期很短[18]，許多細(xì)胞制品在給患者移植之前其效能就已經(jīng)發(fā)生了變化，因此這需要考慮細(xì)胞的一致性和細(xì)胞的穩(wěn)定性。對(duì)于細(xì)胞的一致性來說，干細(xì)胞受不同供體的影響，包括年齡、性別、身體狀況等，細(xì)胞的來源不同，細(xì)胞的增長(zhǎng)率、細(xì)胞的分化能力、染色體的穩(wěn)定性、移植入體內(nèi)的活性等也會(huì)不同[19]，如供體的年齡較大，則MSCs老化會(huì)更快，其生物學(xué)活性也會(huì)較差。每一批次來源于不用供體的細(xì)胞在治療時(shí)也應(yīng)考慮人類白細(xì)胞抗原的配型，因?yàn)楫愒醇?xì)胞移植最大的障礙就是免疫排斥現(xiàn)象。細(xì)胞穩(wěn)定性也是需要注意的問題，細(xì)胞產(chǎn)品不同于傳統(tǒng)藥物，因?yàn)槠涫且环N“活的”物質(zhì)，受到來源、培養(yǎng)過程及貯存的限制，所以在細(xì)胞移植之前需要檢測(cè)細(xì)胞的穩(wěn)定性包括關(guān)鍵基因的表達(dá)、染色體的穩(wěn)定性和表觀遺傳學(xué)的穩(wěn)定性（甲基化、miRNA、組蛋白乙?；蚗染色體的失活）等。endprint

3 細(xì)胞的移植

一般來說細(xì)胞移植主要包括兩種方法。①局部移植：在損傷部位采取單點(diǎn)或多點(diǎn)局部直接注射；②靜脈移植：將MSCs經(jīng)靜脈注射以到達(dá)損傷部位。然而，在臨床上采用MSCs移植治療無法確定細(xì)胞的劑量保證其有效性[20]，這需要在基礎(chǔ)和臨床研究中進(jìn)一步探討。另外，細(xì)胞移植還可能存在免疫抑制、刺激惡性腫瘤的生長(zhǎng)以及細(xì)胞的病態(tài)分化等問題[21]。

采取不同的移植方法可能引起不同的移植問題，將MSCs局部移植到損傷部位可能引起局部的病理反應(yīng)，而靜脈移植可能引起更大的反應(yīng)，如移植的細(xì)胞可能并沒有進(jìn)入損傷部位而是流到了機(jī)體的主要器官[22-23]，包括肺臟、心臟、脾臟、腎臟、肝臟等，這樣就影響了其治療效果。MSCs的低免疫原性使其在治療難治性自身免疫性疾病中開辟了一個(gè)新的治療方法，但這種低免疫原性也會(huì)引起產(chǎn)品的安全性問題。MSCs的移植可能逃避免疫監(jiān)視，使受體更容易受到機(jī)會(huì)性感染。如果移植的細(xì)胞中含有腫瘤細(xì)胞，那么MSCs就可能變?yōu)槟[瘤相關(guān)的表型而通過直接或間接促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移或血管生成而支持腫瘤的生長(zhǎng)[24]，盡管還不清楚MSCs是否通過免疫調(diào)節(jié)、營(yíng)養(yǎng)還是其他的原因而促進(jìn)了腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)。有些患有如糖尿病、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡和多發(fā)性硬化病等疾病的患者，不能采用自體干細(xì)胞移植，需要異源的干細(xì)胞進(jìn)行治療，但當(dāng)異源的MSCs移植入體內(nèi)，MSCs有可能被機(jī)體認(rèn)為是外來物質(zhì)，而產(chǎn)生排斥反應(yīng)，這樣不僅不能起治療效果，而且可能給患者造成嚴(yán)重的危害。

將MSCs移植到一個(gè)本來不屬于其的地方，是有一定潛在的風(fēng)險(xiǎn)。人們已日益認(rèn)識(shí)到具有“干性”特征的細(xì)胞幾乎存在于所有類型的組織，如神經(jīng)系統(tǒng)、骨髓、外周血、脂肪組織、皮膚等。在過去的幾十年中，隨著干細(xì)胞領(lǐng)域的蓬勃發(fā)展，發(fā)現(xiàn)這些具有“干性”特征的細(xì)胞可以根據(jù)不同微環(huán)境的影響而發(fā)生不同的分化。細(xì)胞移植是從原來的微環(huán)境轉(zhuǎn)移到了一個(gè)新的環(huán)境。在新環(huán)境中的干細(xì)胞可能分化為理想的細(xì)胞，但這些有“干性”的細(xì)胞也可能形成腫瘤或分化為損傷修復(fù)不需要的細(xì)胞[25]，甚至細(xì)胞的聚集位置也不確定。移植MSCs后，當(dāng)Wnt信號(hào)通路被抑制，MSCs有轉(zhuǎn)化為肉瘤的潛能。這并不奇怪，因?yàn)樵谖h(huán)境作用和病理情況變化下，來源于非損傷組織的MSCs會(huì)繼續(xù)其自然發(fā)育趨勢(shì)產(chǎn)生非損傷組織的物質(zhì)，從而產(chǎn)生腫瘤，所以，在干細(xì)胞移植的應(yīng)用中，應(yīng)注意避免這些問題，但遺憾的是，現(xiàn)在許多難治性疾病在傳統(tǒng)治療失效的情況下，不得不采取細(xì)胞療法。

綜上所述，在細(xì)胞療法的臨床應(yīng)用中，需要考慮其安全性的問題。對(duì)于這些安全性的隱患其根本原因在于醫(yī)療機(jī)構(gòu)個(gè)體化治療受制于人員技能、場(chǎng)所、時(shí)間等，造成誤差累積，也難以滿足大規(guī)模臨床需求；采集、采購、建庫、制備、保存、檢測(cè)、評(píng)價(jià)、傳輸、回輸需要社會(huì)專業(yè)化分工完成；工藝路線及注射液處方設(shè)計(jì)不合理，未通過極限挑戰(zhàn)考察；干細(xì)胞制品開發(fā)需要通過系統(tǒng)化、科學(xué)化的研究，質(zhì)量研究應(yīng)與動(dòng)物實(shí)驗(yàn)、臨床實(shí)驗(yàn)有機(jī)結(jié)合起來，進(jìn)行全方位、全過程質(zhì)量控制。人類對(duì)干細(xì)胞的認(rèn)識(shí)尚處幼稚階段，作用靶點(diǎn)和機(jī)制不清、體內(nèi)轉(zhuǎn)歸不明、移植后持續(xù)不良反應(yīng)無法終止、長(zhǎng)期植入后果不確定、法規(guī)和技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)缺位，因此干細(xì)胞濫用必然會(huì)帶來災(zāi)難性的后果，尤其是在發(fā)展中國(guó)家，這種現(xiàn)象更為普遍。相關(guān)監(jiān)管部門應(yīng)建立健全一套細(xì)胞療法的標(biāo)準(zhǔn)和準(zhǔn)則，消除存在的安全隱患，期盼干細(xì)胞移植在經(jīng)歷基礎(chǔ)和臨床實(shí)驗(yàn)后能真正應(yīng)用于臨床治療，為患者帶來福音。

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（收稿日期：2014-09-26 本文編輯：李亞聰）endprint