張積廣

福建省立醫(yī)院胸外科，福建福州 350001

非小細胞肺癌的發(fā)病率及病死率高，對放化療不敏感，療效欠佳。紫杉醇是非小細胞肺癌治療的一線化療藥物，臨床應(yīng)用較廣泛，其抗腫瘤機制主要是通過凋亡促使腫瘤細胞死亡，而凋亡抵抗是惡性腫瘤細胞的一個重要生物學(xué)特征，嚴重降低紫杉醇的治療效果，因此有效提高紫杉醇促凋亡功能，可增強其抗腫瘤作用，提高其療效。microRNA 是單鏈非編碼小分子RNA，其在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因的表達，是腫瘤學(xué)近年研究的熱點，據(jù)文獻[1]報道m(xù)iRNA 可改變腫瘤細胞對化療藥物的敏感性。該研究起止時間為2013年1月—2014年5月，旨在闡明miR-101 促進紫杉醇誘導(dǎo)非小細胞肺癌細胞凋亡，并探討其可能機制，現(xiàn)報道如下。

1 方法

1.1 細胞培養(yǎng)

H358(支氣管肺泡癌)和H226(鱗癌)細胞株購自ATCC，細胞株在含10% FBS、含雙抗(100 IU 青霉素和100 μg/mL 鏈霉素)的RPMI-1640 培養(yǎng)液中培養(yǎng)。

1.2 miRNA-101mimics 和siRNA 的細胞轉(zhuǎn)染

按照Lipofectamine 2000 說明書的步驟進行轉(zhuǎn)染。將適當(dāng)數(shù)量肺癌細胞接種于96 孔或6 孔板，細胞匯合度達到50%～60%時進行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染后6 h，更換培養(yǎng)液為含10%FBS 的DMEM。

1.3 實時定量PCR

用Trizol 從細胞中提取總RNA。

①microRNA-101 表達檢測

按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將miRNA 逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，將逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進行實時定量PCR 擴增，反應(yīng)體系如下。

2×Real-time PCR Buffer 10 μL，miR specific Primer set(5μmol/L)0.6 μL miRNA RT product(物稀釋3 倍)2 μL，Taq DNA polymerase（5 U/μL）0.2 μL，dd H2O To 20 μL?；靹蛏鲜龈鹘M分，95 ℃3 min,95 ℃12 s，58 ℃40 s，40 個循環(huán)，PCR 反應(yīng)在ABI 7500 熒光定量PCR 儀上完成。U6 作為內(nèi)參，用2-△△ct 法計算。該實驗重復(fù)3 次。

②EZH2-mRNA 表達檢測

按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將RNA 逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，將逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進行實時定量PCR 擴增，反應(yīng)體系如下。

上、下游引物各(10 μmol/L)1 μL，SYBR Green Real-time PCR Master Mix 12.5 μL，逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物(稀釋10 倍)1 μL，Add H2O to final 25 μL。將上述各部分混勻。95 ℃60 s；95 ℃15 s，56 ℃15 s，72 ℃45 s，共40 個循環(huán)。

1.4 Western Blot

每個孔均加入細胞裂解液充分搖勻，在冰上作用30 min 后進一步離心后吸取上清液，蛋白濃度用Bi-Rad 蛋白測定試劑盒測定，-70℃保存于深低溫冰箱。取30 μg 樣品進行凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜，在室溫下封閉1 h 后分別與相應(yīng)一抗、二抗充分相互作用，最后用ECL 化學(xué)發(fā)光試劑進行檢測。將膠片進行掃描，用凝膠圖像處理系統(tǒng)分析。

1.5 細胞凋亡檢測

將肺癌細胞接種于6 孔板中，轉(zhuǎn)染方法同前，將每種細胞分為4 組即siRNA-EZH2 組、siRNA 陰性對照組及轉(zhuǎn)染miR-101組、miRNA 陰性對照組。將紫杉醇（終濃度為40 nmol/L）加入轉(zhuǎn)染72 h 后細胞，并孵育48 h。將收集的每組細胞分為倆份，一份用于Annexin V-FITC 凋亡檢測，而另外一份用于western blot 檢測凋亡相關(guān)蛋白，按試劑盒說明操作。

1.6 統(tǒng)計方法

所有數(shù)據(jù)均以SPSS13.0 統(tǒng)計軟件包進行統(tǒng)計分析。計量資料以均數(shù)±標準差(±s)表示。

2 結(jié)果

2.1 miR-101 過表達或EZH2 基因沉默增強紫杉醇誘導(dǎo)的肺癌細胞凋亡

非小細胞肺癌H358 和H226 細胞株對紫杉醇的藥物敏感性低，因而被用于該研究。EZH2 是miR-101 的靶基因，具有癌基因特性，促進非非小細胞肺癌的發(fā)生發(fā)展，因此將沉默EZH2 表的siRNA-EZH2 作為陽性對照。miR-101 mimics 或siRNA-EZH2轉(zhuǎn)染細胞72 h 后再加入紫杉醇培養(yǎng)48 h，用流式檢測細胞凋亡，結(jié)果表明miR-101 過表達或EZH2 基因沉默(圖A)顯著增強腫瘤細胞對紫杉醇敏感性，導(dǎo)致腫瘤細胞凋亡數(shù)量顯著上升(圖B 和圖C)。

圖A miR-101 mimics 或siRNA-EZH2 的轉(zhuǎn)染效果通過實時定量PCR 檢測miR-101 或EZH2 mRNA 的表達而確認。miR-101：轉(zhuǎn)染miR-101 組；miR-CON：轉(zhuǎn)染miRNA 陰性對照組；siRNA-EZH2：轉(zhuǎn)染siRNA-EZH2 組；siCON：轉(zhuǎn)染siRNA 陰性對照組。

圖B annexin V-FITC/PI 雙染流式細胞檢測細胞凋亡。數(shù)據(jù)以相應(yīng)陰性對照組作為標準化顯示。Apoptotic cells：凋亡細胞。

圖C 具有代表性流式細胞凋亡檢測圖顯示miR-101 過表達或沉默EZH2 增強紫杉醇誘導(dǎo)的細胞凋亡。

2.2 miR-101 抑制EZH2 表達并增強凋亡相關(guān)蛋白Bim 和cleaved PARP 的表達

為了研究miR-101 增強腫瘤細胞對紫杉醇敏感性的可能機制，同時我們亦收集上述與紫杉醇培養(yǎng)48 h 后的肺癌細胞，用于檢測凋亡相關(guān)蛋白。既往研究提示促凋亡蛋白Bim 是決定腫瘤細胞對紫杉醇敏感性的重要因子[2]，而EZH2 抑制Bim 表達[3]，所以我們檢測凋亡相關(guān)蛋白EZH2、Bim、和cleaved PARP 的表達。該實驗結(jié)果表明，EZH2 蛋白在miR-101 和siRNA-EZH2 轉(zhuǎn)染細胞組的表達水平顯著低于相應(yīng)的陰性對照組，而Bim 和cleaved PARP 蛋白在miR-101 和siRNA-EZH2 轉(zhuǎn)染細胞組的表達水平顯著高于相應(yīng)的陰性對照組(圖D 和圖E)。

圖D Western blot 檢測凋亡相關(guān)蛋白EZH2,Bim 和cleaved PARP的表達。β-actin 作為內(nèi)參，數(shù)據(jù)以相應(yīng)陰性對照組作為標準化顯示。

圖E 具體代表性的wenstern blot 條帶顯示miR-101 or siRNAEZH2 增加Bim 和cleaved PARP 蛋白的表達.以上所有實驗均獨立重復(fù)3 次。*P<0.05;** P<0.001。

3 討論

非小細胞肺癌對化學(xué)藥物治療不敏感，且預(yù)后通常欠佳[4-6]，這種狀況在過去的幾十年中并未得到改善。紫杉醇是當(dāng)前廣泛應(yīng)用于非小細胞肺癌治療的臨床一線藥物，主要通過誘導(dǎo)細胞凋亡導(dǎo)致腫瘤細胞死亡，雖然其取得一定臨床治療成績，但并不理想，若能進一步提高其療效則有益于肺癌患者。因此，檢測miR-101 能否增進紫杉醇誘導(dǎo)的非小細胞肺癌細胞凋亡及其可能的機制值得進一步深入研究。該研究顯示提高miR-101 表達或沉默EZH2 基因均能促進紫杉醇誘導(dǎo)肺癌細胞凋亡，同時亦降低EZH2 蛋白表達和增強Bim 蛋白表達。先前文獻研究顯示Bim能增進非小細胞肺癌細胞對紫杉醇的藥物敏感性，而下調(diào)Bim基因表達則顯著減少紫杉醇導(dǎo)致的非小細胞肺癌細胞死亡，此表明Bim 是連接紫杉醇和凋亡之間的一個重要分子。EZH2 已經(jīng)被證實能通過后生性抑制Bim 表達而減少腫瘤細胞凋亡。結(jié)合上述科研成果，研究結(jié)果提示miR-101 調(diào)節(jié)紫杉醇誘導(dǎo)非小細胞肺癌凋亡的機制如下：由miR-101 介導(dǎo)的EZH2 低表達誘導(dǎo)Bim 蛋白生成，因此增強紫杉醇誘導(dǎo)的非小細胞肺癌凋亡。

綜上，在非小細胞肺癌中miR-101 能增強紫杉醇誘導(dǎo)的肺癌細胞凋亡。該研究結(jié)果提示miR-101 和EZH2 可能成為臨床非小細胞肺癌治療的潛在新靶點，有望改善非小細胞肺癌患者的臨床治療效果。

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