王曉亮 李紹剛 李賽飛 林寒冰 曹斌校 王 軍

奉化市人民醫(yī)院，浙江奉化 315500

據(jù)Pakin 研究報(bào)道，胃癌為高發(fā)生率腫瘤，其死亡例數(shù)排位世界第二[1]。流行病學(xué)顯示胃癌在我國(guó)是最常見的惡性腫瘤之一。雖然胃癌的診療技術(shù)有了很大的提高，但是多數(shù)患者就診時(shí)處于晚期，總體預(yù)后仍較差。ABCC4(ATP-binding cassette，subfamily C member 4)，是Cole 等研究小細(xì)胞肺癌時(shí)發(fā)現(xiàn)的耐藥基因家族成員[2]。CEA 為癌胚抗原,屬于CEA 基因家族成員。該研究通過檢測(cè)胃癌組織標(biāo)本中的ABCC4、CEA 表達(dá)水平，分析其與胃癌臨床病理因素的相關(guān)性，以期作為評(píng)估治療及預(yù)后的標(biāo)志物，現(xiàn)分析2010年1月—2013年1月間該院收治的100 例胃癌患者的臨床資料，報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

隨機(jī)選取在該院收治的胃癌患者100 例。病例特點(diǎn)：男性76例，女性24 例；年齡29～80 歲，平均年齡（61.23±10.4）歲。手術(shù)后病理結(jié)果：pT2 13 例，pT3 51 例，pT4?36 例；淋巴結(jié)pN0 28 例，pN1 21 例，pN2 26 例，pN3 25 例；pTNM 分期：IIA 期7 例，IIB 期23 例，IIIA 期19 例，IIIB 期21 例，V 期8 例；隨訪到2013年7月，隨訪期間死亡20 例。病例納入標(biāo)準(zhǔn)：符合美國(guó)癌癥聯(lián)合委員會(huì)(AJCC )(第7 版)進(jìn)展（期）胃癌診斷標(biāo)準(zhǔn)。排除標(biāo)準(zhǔn)：術(shù)前化療，術(shù)前放療，術(shù)前行胸片、腹部CT 檢查肺部、肝臟、腹主動(dòng)脈旁淋巴結(jié)等遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移者。

1.2 試劑與方法

1.2.1 標(biāo)本 所有組織蠟塊均由該院病理科包埋，每例胃癌組織病理切片均由兩位專家確診。胃粘膜組織取自上述100 例標(biāo)本距癌組織3 cm 以上的癌旁胃粘膜組織。

1.2.2 試劑 ABCC4 單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)SantaCruz 公司，CEA單克隆抗體購(gòu)自福州邁新生物開發(fā)公司。

1.2.3 方法 采用免疫組織化SP 法。將標(biāo)本連續(xù)切片，常規(guī)脫蠟、水化，經(jīng)3%的H2O2消化內(nèi)源性過氧化物酶，高壓抗原修復(fù)，一抗(鼠抗人ABCC4、CEA 單克隆抗體)、二抗(生物素標(biāo)記)作用后，用DAB 顯色，蘇木素復(fù)染后脫水透明，常規(guī)中性樹膠封固后顯微鏡下觀察。以PBS 代替一抗作陰性對(duì)照。

1.3 免疫組化結(jié)果判定

ABCC4 陽性表達(dá)定位于細(xì)胞膜或漿，呈現(xiàn)棕黃色或棕褐色顆粒，取5 個(gè)高倍視野，每個(gè)視野分別計(jì)數(shù)100 個(gè)細(xì)胞，計(jì)算陽性細(xì)胞所占百分率。染色結(jié)果根據(jù)陽性細(xì)胞占比率分為4 個(gè)等級(jí)，<5%為0 分；6～25%為1 分；26～50%為2 分，51～75%為3 分；≥76%為4 分。按著色程度計(jì)分：未著色為0 分；淡黃色為1 分；棕黃色為2 分，棕褐色為3 分，兩種記分所得分值之和：0～1 分為陰性（0）；2 分為弱陽性（+）；3～4 分為中度陽性（++）；≥5 分為強(qiáng)陽性（+++）。

CEA 陽性表達(dá)定位與胞漿，呈現(xiàn)棕黃色或棕褐色顆粒，取5個(gè)高倍視野，每個(gè)視野分別計(jì)數(shù)100 個(gè)細(xì)胞，以切片中陽性數(shù)大于25%為陽性。

1.4 統(tǒng)計(jì)方法

所有數(shù)據(jù)均經(jīng)SPSS17.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)。相關(guān)性采用Spearman 法分析。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 ABCC4 在胃癌組織和癌旁胃粘膜組織中的表達(dá)

100 例胃癌組織中ABCC4 陽性表達(dá)19 例，陽性表達(dá)率為19%；100 例癌旁胃粘膜組織中ABCC4 陽性表達(dá)1 例,陽性表達(dá)率為1%.ABCC4 在胃癌組織中的陽性表達(dá)率明顯高于胃粘膜組織中的陽性表達(dá)率，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=4.263，P=0.039＜0.05)，見圖1，圖2。

圖1 ABCC4 在胃癌癌旁胃粘膜組織的陰性表達(dá)

圖2 ABCC4 在胃癌組織的陽性表達(dá)

2.2 ABCC4 在胃癌中的表達(dá)與臨床病理因素的關(guān)系

在100 例胃癌標(biāo)本中，ABCC4 陽性表達(dá)率在T2、T3、T4 分別為0%、17.6%、27.8%，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；ABCC4 陽性表達(dá)率在N0、N1、N2、N3 分別為17.9%、19.0%、23.1%、16.0%，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；ABCC4 陽性表達(dá)率在胃低分化腺癌、高分化腺癌中分別為11.3%、27.7%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，ABCC4 陽性表達(dá)率在是否復(fù)發(fā)中分別為17.4%、19.5%，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見圖3，圖4，表1。

圖3 ABCC4 陽性表達(dá)率在胃低分化腺癌的陽性表達(dá)

圖4 ABCC4 陽性表達(dá)率在胃高分化腺癌的陽性表達(dá)

2.3 CEA 在胃癌中的表達(dá)與臨床病理因素的關(guān)系

在100 例胃癌標(biāo)本中，CEA 陽性表達(dá)率在T2、T3、T4 分別為38.5%、33.3%、36.1%，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；CEA 陽性表達(dá)率在N0、N1、N2、N3 分別為28.6%、42.9%、26.9%、44.0%，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；CEA 陽性表達(dá)率在胃高分化腺癌、低分化腺癌中分別為23.4%、45.2%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，CEA陽性表達(dá)率在是否復(fù)發(fā)中分別為30.4%、36.4%，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表2。

表1 ABCC4 與胃癌臨床病理因素的關(guān)系

表2 CEA 與胃癌臨床病理因素的關(guān)系

2.4 胃癌組織中CEA 與ABCC4 表達(dá)水平的相關(guān)性分析

在CEA 表達(dá)陽性的35 例中，ABCC4 陽性表達(dá)占6 例；在CEA 表達(dá)陰性65 例中，ABCC4 陽性表達(dá)占13 例，Spearman 法分析顯示CEA 和ABCC4 在胃癌組織中表達(dá)無相關(guān)性，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表3。

表3 胃癌組織中CEA 與ABCC4 表達(dá)水平的相關(guān)性分析

3 討論

ABCC4 在人類中定位于染色體13q32，長(zhǎng)312kb，含有31 個(gè)外顯子[3]，是ABC 家族中結(jié)構(gòu)最簡(jiǎn)單的蛋白[4]，廣泛分布于胰腺和腸等多種組織中[5-6]。結(jié)直腸癌、頭頸鱗癌細(xì)胞中ABCC4 強(qiáng)表達(dá)[7-8]，提示ABCC4 與腫瘤的發(fā)生發(fā)展相關(guān)。佟柏峰等[9]通過ABCC4 基因RNAi 有效靶點(diǎn)慢病毒(ABCC4siRNA)感染SGC-7901 細(xì)胞的研究表明，ABCC4 基因能促進(jìn)胃癌細(xì)胞增殖。本研究通過免疫組化法發(fā)現(xiàn)ABCC4 在胃癌組織中呈高表達(dá)，并且陽性率明顯高于癌旁胃粘膜組織，說明了ABCC4 與胃癌的發(fā)生相關(guān)。

此外，該研究還發(fā)現(xiàn)，ABCC4 表達(dá)水平與胃癌組織分化程度相關(guān)。在高分化胃癌組織中ABCC4 表達(dá)的陽性率明顯高于低分化胃癌，提示隨著胃癌的惡性程度進(jìn)展,ABCC4 陽性表達(dá)率下降。臨床發(fā)現(xiàn)某些分化程度低、惡性程度高的癌癥患者較分化程度高的患者對(duì)化療敏感,結(jié)合Yasui 等[10]比較順鉑耐藥腫瘤細(xì)胞KK47/cDDP1O 的ABCC4 拷貝數(shù)高于順鉑敏感腫瘤細(xì)胞的ABCC4 拷貝數(shù)，提示ABCC4 在癌組織中的陽性表達(dá)率增高可能是腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物產(chǎn)生耐藥性的原因之一，有待進(jìn)一步分組研究證實(shí)。

CEA 是癌細(xì)胞膜上的一種結(jié)構(gòu)蛋白，通常在體內(nèi)濃度極低，但來自內(nèi)胚層組織惡變時(shí)，如胃癌、肝癌、肺癌等組織中濃度可升高[1，11]。該研究發(fā)現(xiàn)胃高分化腺癌的CEA 陽性表達(dá)率高低于低分化腺癌的陽性表達(dá)率，這提示胃癌分化程度越低,CEA 陽性表達(dá)率越高，與王海燕等[12]的報(bào)道相符。

目前對(duì)腫瘤發(fā)生機(jī)制的研究已從單一基因發(fā)展到多基因協(xié)同作用和互相調(diào)節(jié)的研究。該研究發(fā)現(xiàn)CEA 和ABCC4 表達(dá)水平與胃癌的分化程度有關(guān)，但用Spearman 法分析發(fā)現(xiàn)CEA 和ABCC4 在胃癌組織中的表達(dá)無相關(guān)性，這提示CEA 和ABCC4對(duì)胃癌細(xì)胞的調(diào)控可能沒有協(xié)同作用，可能通過不同的調(diào)控機(jī)制起作用。如CEA 可誘導(dǎo)CEACAM1 介導(dǎo)的凋亡途徑[13]，ABCC4可通過參與轉(zhuǎn)運(yùn)細(xì)胞cAMP 和cGMP 等內(nèi)源性分子，調(diào)控細(xì)胞內(nèi)的環(huán)核苷酸水平，調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡[14]。

綜上所述，該研究通過免疫組化法觀察ABCC4 和CEA 在胃癌組織中的表達(dá)水平，分析其與胃癌臨床病理因素的關(guān)系,證明了ABCC4 和CEA 表達(dá)與胃癌的分化程度有關(guān)，但二者的調(diào)控沒有協(xié)同作用，聯(lián)合檢測(cè)ABCC4 和CEA，可能有助于對(duì)胃癌分化程度做出準(zhǔn)確的評(píng)價(jià)。

[1]焦淑成，王恒，杜彥崢.血清CEA 和CA199 表達(dá)水平評(píng)估胃癌病情的應(yīng)用價(jià)值[J].國(guó)際檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志,2014,35(6):661-666.

[2]Lin X，Ramamurtbi K，Mishima M，et al.P53 modulates theeffectoflossof DNA mismatch repair on the sensitivity of human colon cancer cells to thecytotoxicand mutagenic effects ofcisplatin[J].Cancer Res,2001，61(4):1508-1516.

[3]Lamba JK，Adachi M，Sun D，et a1.Nonsense mediated decay down regulates conserved alternatively spliced ABCC4 transcripts bearing nonsense codons[J].Hum Mol Genet，2003，12(2):99-109.

[4]Ravna AW，Sager G.Molecular modeling studies of ABC transporters involved in multidrug resistance[J].Mini Rev MedChem，2009，9(2)：186-193.

[5]RavnaAW，Sylte I，Sager G.Binding site of ABC transporterho mologymodels confirmed by ABCB1crystastructure[J].TheorBiolMed Model，2009，6:20.Published online Sep 4,2009.

[6]張廣鈺，田小林.ABCC4 基因與胃癌關(guān)系的研究進(jìn)展[J]華夏醫(yī)學(xué)，2012,25（6）：920-923.

[7]Holla VR，Backlund MG，Yang P，et al.Regulation of prostaglandin transporters in colorectalneoplasia[J].CancerPrev Res，2008，1(2)：93-99.

[8]Sethi S，Benninger MS，Lu M，et al.Noninvasive molecular detection of head and necksquamouscell carcinoma：an exploratory analysis[J].Diagn-Mol Pathol，2009，18(2)：81-87.

[9]佟柏峰，李云龍，宋茂力，等.ABCC4 表達(dá)與胃癌細(xì)胞增殖的相關(guān)研究[J].國(guó)際遺傳學(xué)雜志，2010，10(6)：326-329.

[10]YasuiK，MiharaS，Zhao C，et a1.Alteration in copy numbers of genes as a mechanism for acquired drug resistance[J].Cancer Res，2004，64(4)：1403-1410.

[11]Caleagno DQ,Leal MF,Seabra AD,et al.Interrationship between chromosome 8 aneuploidy,C-MYC amplifireation and inereased expression in individuals from northern Brazil was gastric adenocarcinoma[J].World J Gastroenterol,2006,12(38):6207-6221.

[12]王海燕,姚桂芹,高佩增,等.CA242,CEA,CA199 在胃癌及癌前病變組織中表達(dá)的相關(guān)研究[J].臨床消化病雜志,2005,17(6):279-811.

[13]Stern N,Markel G,Arnon TI,et al.Carcinoembryonic antigen(CEA)inhibits nk killing via interaction with cea -related cell adhesion molecule1[J].J Immunol,2005,174(11):6692-6701.

[14]SassiY，LipskaiaL，VandecasteeleG，et al.Multidrug resistance-associated protein 4 regulatescAMP-dependent signaling pathways and controls human and rat SMC proliferation[J].J Clin Invest,2008,118(8):2747-2757.