徐國榮 馮秀蘭 許作鵬

1.江門市人民醫(yī)院婦科，廣東江門 529000；2.江門市人民醫(yī)院檢驗科，廣東江門 529000；3.江門市人民醫(yī)院病理科，廣東江門 529000

T 細胞免疫球蛋白黏蛋白家族（Tim family）是一類參與調(diào)節(jié)機體免疫的關(guān)鍵分子，自發(fā)現(xiàn)以來，其功能受到廣泛關(guān)注。目前人們研究比較多的Tim 分子主要是Tim-1，Tim-3，Tim-4,等，其中Tim-3 因其在抗腫瘤免疫方面的作用而被重視[1]。越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，Tim-3 表達于多種腫瘤相關(guān)的免疫細胞，且其表達水平和功能各異，主要是通過參與T 細胞功能障礙或是耗竭以及擴增髓系來源移植細胞增殖等在腫瘤免疫中其著負向調(diào)控作用[2]。而半乳凝素9（Gal-9）作為Tim-3 的特異性配體，與Tim-3 一起調(diào)控機體抗腫瘤的免疫應(yīng)答[3]。

在發(fā)展中國家，宮頸鱗狀細胞癌（SCC）在女性惡性腫瘤中位居第2 位，僅次于乳腺癌，嚴重威脅著婦女的健康。該研究應(yīng)用Western blot、qRT-PCR 以及ELISA 技術(shù)，探究Tim-3 及其配體Gal-9 在不同分化宮頸鱗癌中的表達，從而為臨床尋找有意義的檢測指標(biāo)?，F(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

經(jīng)患者知情同意，收集江門市人民醫(yī)院2012年6月—2014年6月就診宮頸鱗狀細胞癌（SCC）患者組織及血清樣本共38例，根據(jù)組織病理學(xué)分級，其中低分化癌（PSCC）11 例，中分化癌（MSCC）12 例，高分化癌（WSCC）15 例，依次設(shè)為PSCC 組、MSCC組以及WSCC 組。收集同期來診上皮瘤樣病變（CIN）患者組織及血清樣本共17 例以及健康婦女血清樣本共17 例，分別設(shè)為CIN組以及正常組。其中正常組、CIN 組、PSCC 組、MSCC 組、WSCC 組患者平均年齡分別為41±3.2、41.5±2.3、40±2.0、41±2.5、43±3.0歲，各組年齡經(jīng)t 檢驗分析，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），各組患者術(shù)前均未經(jīng)過放化療。

1.2 方法

1.2.1 癌組織樣本中Tim-3 及Gal-9 表達檢測 采用Western blot 技術(shù)檢測CIN 組、PSCC 組、MSCC 組、WSCC 組組織樣本中Tim-3 以及Gal-9 蛋白的表達。分別取各組組織樣本100mg，采用IM-PER 蛋白抽提試劑（購自Therrmo 公司）抽提蛋白，通過BCA 蛋白濃度定量試劑盒（購自Thermo 公司）進行定量，定量蛋白上樣后進行電泳及轉(zhuǎn)膜，分別采用抗Tim-3 抗體以及抗Gal-9抗體對硝酸纖維素膜進行第1 次孵育，分別采用HRP 標(biāo)記的相應(yīng)抗體進行二次孵育，采用熒光化學(xué)法顯色，觀察結(jié)果；采用qRT-PCR 檢測CIN 組、PSCC 組、MSCC 組、WSCC 組組織中Tim-9 以及Gal-9 的表達。取各組組織樣本100 mg，采用TRIZOL 法抽提組織樣本總RNA，經(jīng)一步法反轉(zhuǎn)錄試劑盒（購自Takara 公司）進行反轉(zhuǎn)錄PCR 后，采用SYBRR 熒光定量試劑進行qRTPCR 進行定量檢測。以上檢測均以GAPDH 作為內(nèi)參，以CIN 組作為對照組，其中qRT-PCR 引物序列如下：

Tim-3 正義：5'-CAGATACTGGCTAAATGGGGAT-3'，

反義:5'-ACCTTGGCTGGTTTGATGAC-3'；

Gal-9 正義：5'-AATGGCCTTCAGCGGTTCCCAG-3'，

反義：5'-CTATGTCTGCACATGGGTCAG-3'；

GAPDH 正義：5'-TGACCACAGTCCATGCCATC-3'，

反義：5'-GACGGACACATTGGGGGTAG-3'

1.2.2 血清中Gal-9 的表達檢測 采用ELISA 檢測正常組、CIN組、PSCC 組、MSCC 組、WSCC 組血清中Gal-9 的表達量，取各組外周血進行30 min 2 000 rpm 離心，取上清采用ELISA 試劑盒（購自R&D 公司）進行Gal-9 濃度檢測。

1.3 統(tǒng)計方法

通過GraphPad prism 5.0 軟件，采用t 檢驗分別計算Tim-3及其配體Gal-9 在組間表達差異性分析。通過SPSS 17.0 軟件，采用spearman 檢驗分別計算Tim-3 以及Gal-9 與不同病理分級的宮頸鱗狀細胞癌之間相關(guān)性。

2 結(jié)果

2.1 Tim-3 在宮頸鱗狀細胞癌組織中的表達

Western blot 結(jié)果顯示，在宮頸鱗狀細胞癌組織中Tim-3 的表達比CIN 高，并且，Tim-3 表達量隨著病理分級的改變而改變，具體表現(xiàn)為WSCC 較MSCC 高，MSCC 較PSCC 高（圖1，A）。通過qRT-PCR 我們在mRNA 水平上加以驗證，也得到了同蛋白水平相似的結(jié)果，即Tim-3 的表達在SCC 中較高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），且由PSCC 至WSCC 逐漸上調(diào)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）（圖1，A）。

圖1 Tim-3 在CIN 組、PSCC 組、MSCC 組、WSCC 組組織中的表達。A，Western blot 檢測Tim-3 在各組組織中的表達；B，qRT-PCR 檢測Tim-3 在各組組織中的表達，*P<0.05

2.2 Gal-9 在宮頸鱗狀細胞癌組織中的表達

實驗結(jié)果顯示，Gal-9 的表達與Tim-3 的表達變化高度相似。其中，Western blot 結(jié)果顯示，Gal-9 在SCC 組織中表達高于CIN，且由PSCC 向WSCC 逐步遞增（圖2，A）。通過qRT-PCR 我們對結(jié)果進一步驗證發(fā)現(xiàn)，Gal-9 在SCC 中較CIN 表達上調(diào)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）,且其表達隨著癌組織分化程度增高而上調(diào)（圖2，B）。

圖2 Gal-9 在CIN 組、PSCC 組、MSCC 組、WSCC 組組織中的表達。A，Western blot 檢測Tim-3 在各組組織中的表達；B，qRT-PCR 檢測Tim-3 在各組組織中的表達，*P<0.05。

2.3 血清中Gal-9 的表達量與病理分級的相關(guān)性

ELISA 結(jié)果顯示，SCC 患者血清中Gal-9 表達量較正常以及CIN 高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），在不同病理分級中，Gal-9的表達量隨癌組織分化程度增加而增加，且各級間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）（圖3）。spearman 秩相關(guān)系數(shù)，r=0.687 顯示血清中Gal-9 表達量與癌組織分化程度呈現(xiàn)明顯正相關(guān)性。

圖3 ELISA 檢測各組血清中Gal-9 的表達量，*P<0.05。

2.4 組織中Tim-3 和Gal-9 基因表達與病理分級的相關(guān)性

進一步分析qRT-PCR 數(shù)據(jù)顯示，宮頸鱗狀細胞癌病理分級與Tim-3 和Gal-9 基因表達差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），spearman秩相關(guān)系數(shù)，分別是0.738 和0.671,說明病理分級與Tim-3 和Gal-9 基因表達均呈現(xiàn)明顯正相關(guān)。這與Gal-9 在血清中的表達量與病理分級的相關(guān)性一致。

3 討論

Tim-3 作為一種抗腫瘤的負向調(diào)控因子，在調(diào)控多種腫瘤凋亡過程中起著重要作用[4]。目前研究報道，Tim-3 在前列腺癌、腎癌、急性白血病以及黑色素瘤等多種癌組織中呈強陽性表達[5-8]。對于宮頸鱗狀細胞癌中Tim-3 的表達以及Tim-3 的表達與宮頸鱗狀細胞癌病理分級的相關(guān)性則仍未有報道。該研究中，Western blot 與qRT-PCR 結(jié)果均顯示Tim-3 在SCC 各組組織中表達高于CIN 組（P<0.05），說明Tim-3 在SCC 中表達，且作為機體抗腫瘤因子在宮頸鱗癌發(fā)生過程中可能起著重要作用，關(guān)于其作用機制尚需進步一研究。進一步分析Tim-3 的表達與病理分級的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)Tim-3 表達在PSCC、MSCC、WSCC 3 組中有明顯差異（P<0.05），且與病理分級呈現(xiàn)明顯的正相關(guān)性（r=0.738），兩者的關(guān)系揭示了Tim-3 可以作為臨床宮頸鱗狀細胞癌病理分級一個重要指標(biāo)，為宮頸鱗狀細胞癌的預(yù)后提供一個有意義的參考指標(biāo)。

該研究又對Tim-3 的特異性配體Gal-9 的表達進行了進一步研究。Gal-9 是Tim-3 的主要配體，與Tim-3 一同在抗腫瘤免疫起著重要的負向調(diào)控作用[9]。已有文獻報道稱血清中Gal-9的表達量與宮頸鱗狀細胞癌的病理分級呈現(xiàn)正相關(guān)關(guān)系[10]，但并未在基因表達水平進步一驗證，且研究過于簡單，沒有深入驗證。首先該研究通過Western blot 驗證了Gal-9 在SCC 中的表達，發(fā)現(xiàn)相比CIN 組，Gal-9 在SCC 各組中均呈強陽性表達，預(yù)示作為Tim-3 的特異性配體Gal-9 可能在癌癥發(fā)展過程中起著重要的調(diào)控作用，而在SCC 各組表達呈現(xiàn)由低分化癌向高分化癌遞增的現(xiàn)象表明Gal-9 可能與病理分級呈正相關(guān)關(guān)系。接下來通過qRT-PCR 在mRNA 水平進一步驗證分析，得到了與Western blot 相似的結(jié)果，分析數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)組織中Gal-9 的表達與癌組織分化程度確實呈現(xiàn)顯著正相關(guān)性（r=0.671，P<0.05）。最后我們在血清中對Gal-9 的表達與病理分級的正相關(guān)性做了進一步驗證，ELISA 結(jié)果顯示，SCC 血清中Gal-9 濃度明顯高于正常婦女以及CIN 組，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義（均為P<0.05），在不同病理分級下，亦由PSCC 至WSCC 呈現(xiàn)明顯遞增關(guān)系（r=0.687）。說明Gal-9 無論是在組織中蛋白和mRNA 表達量還是分泌至外周血中的表達量，均比正常組以及CIN 組高且與病理分級呈正相關(guān)關(guān)系，可以與Tim-3 一同作為病理分級以及預(yù)后的指標(biāo)。

綜上所述，癌組織的分化程度越高，說明惡性程度越低，而Tim-3 以及Gal-9 與病理分級呈現(xiàn)明顯正相關(guān)性，也從側(cè)面揭示了Tim-3 及其配體Gal-9 在抗腫瘤過程中可能起著重要的調(diào)控作用，關(guān)于兩者的作用機制，需要進一步研究。該研究中Tim-3及其配體Gal-9 的表達與宮頸鱗狀細胞癌的病理分級的這種正相關(guān)性關(guān)系可以作為宮頸鱗狀細胞癌病理分級的指標(biāo)，為提高預(yù)后提供參考依據(jù)。

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