黎釗 王平 侯秀麗 劉東銀 王媚 鄭俊惠

Th17和Treg細(xì)胞與蕈樣肉芽腫相關(guān)性研究

黎釗 王平 侯秀麗 劉東銀 王媚 鄭俊惠

目的探討調(diào)節(jié)性T(Treg)細(xì)胞和Th17細(xì)胞在蕈樣肉芽腫不同分期中的變化。方法流式細(xì)胞儀檢測(cè)28例蕈樣肉芽腫、13例大斑塊型副銀屑病、17例扁平苔蘚患者及10例健康對(duì)照外周血Treg細(xì)胞和Th17細(xì)胞百分率，同時(shí)應(yīng)用免疫組化法檢測(cè)40例蕈樣肉芽腫、13例副銀屑病、17例扁平苔蘚及10例健康對(duì)照蠟塊組織中叉頭狀轉(zhuǎn)錄因子P3(FOXP3)和白細(xì)胞介素17(IL-17)的表達(dá)。結(jié)果蕈樣肉芽腫、副銀屑病、扁平苔蘚患者外周血Treg細(xì)胞百分率分別為(8.09±1.68)%，(6.53±1.67)%，(2.84±1.16)%較健康對(duì)照[(1.01±0.35)%]升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。蕈樣肉芽腫、副銀屑病患者外周血Treg細(xì)胞百分率亦高于扁平苔蘚(均P＜0.05)；蕈樣肉芽腫與副銀屑病患者差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。外周血Th17細(xì)胞百分率在蕈樣肉芽腫較副銀屑病、扁平苔蘚患者比健康人升高[(3.22±0.82)%比(2.46±0.79)%，(1.38±0.47)%和(0.59±0.30)%，均P＜0.05]。FOXP3陽性率在蕈樣肉芽腫、副銀屑病及扁平苔蘚均高于正常皮膚組織[(14.94±4.46)%，(11.95±4.72)%，(6.32±2.81)%比(3.43±1.79)%，均P＜0.05]，蕈樣肉芽腫及副銀屑病比扁平苔蘚高(均P＜0.05)，蕈樣肉芽腫比副銀屑病差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。IL-17陽性率在蕈樣肉芽腫、副銀屑病、扁平苔蘚和正常組織中分別為(15.89±4.27)%，(12.02±3.34)%，(4.84±1.93)%和(2.62±0.89)%，其中，蕈樣肉芽腫均高于副銀屑病、扁平苔蘚組織及正常組織(均P＜0.05)。蕈樣肉芽腫、副銀屑病外周血Th17/Treg細(xì)胞比率比扁平苔蘚、健康對(duì)照低(0.41±0.11，0.39±0.12比0.50±0.06，0.57±0.19(均P＜0.05)。早期蕈樣肉芽腫Th17細(xì)胞與Treg細(xì)胞呈正相關(guān)(r=0.423，P＜0.05)，腫瘤期蕈樣肉芽腫Th17細(xì)胞有所下降，而Treg細(xì)胞繼續(xù)升高，但蕈樣肉芽腫各期差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且二者在腫瘤期無相關(guān)性。結(jié)論Treg和Th17細(xì)胞失衡可能參與了蕈樣肉芽腫的發(fā)生與發(fā)展。

蕈樣肉芽腫；T淋巴細(xì)胞，調(diào)節(jié)性；Th17細(xì)胞

蕈樣肉芽腫(MF)是原發(fā)于皮膚的、具有相對(duì)惰性病程的皮膚T細(xì)胞淋巴瘤[1]。與某些皮膚T細(xì)胞異常增生性疾病存在關(guān)聯(lián)，如大斑塊型副銀屑病、扁平苔蘚等[2]。其主要特征是CD4+異形T細(xì)胞的克隆性增生，來源于皮膚特有的“皮膚T細(xì)胞”，通過表面分子如人皮膚淋巴細(xì)胞相關(guān)抗原、CCR4、CXCR3、整合素αEβ7、淋巴細(xì)胞功能相關(guān)分子等與皮膚的內(nèi)皮細(xì)胞、角質(zhì)形成細(xì)胞、朗格漢斯細(xì)胞的相應(yīng)配體結(jié)合，向表皮呈特征性的移入與聚集[3]。MF的這種生物學(xué)行為不僅由發(fā)生基因突變的腫瘤細(xì)胞相關(guān)因子決定，同時(shí)也與其相互作用的非腫瘤細(xì)胞和基質(zhì)等有關(guān)[4]。目前，研究發(fā)現(xiàn)Treg細(xì)胞和Th17細(xì)胞在感染性疾病[5-6]、自身免疫性疾病[7-8]、MF等腫瘤性疾病[9-10]的發(fā)生、發(fā)展及治療后的評(píng)估方面發(fā)揮重要作用。我們認(rèn)為，MF病期與Treg及Th17細(xì)胞的失衡可能密切相關(guān)，并對(duì)MF中Treg細(xì)胞、Th17細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)作出相關(guān)性分析，以期為揭示MF的發(fā)病機(jī)制提供一種思路。

資料與方法

1.標(biāo)本:收集我院皮膚科2008—2013年經(jīng)臨床及組織病理學(xué)檢查證實(shí)的40例MF、13例副銀屑病、17例扁平苔蘚及10例健康對(duì)照組織石蠟存檔標(biāo)本。40例 MF均經(jīng)免疫組化(CD3、CD4和CD45RO陽性等)和(或)基因重排證實(shí)診斷，每例均進(jìn)行 TNMB(tumor，node，metastasis，and blood)分級(jí)，具有完整臨床及組織病理學(xué)資料。40例MF中，女13例，男 27例；發(fā)病年齡(47.1±20.0)歲；按1975年美國(guó)MF研究協(xié)作小組的 T細(xì)胞淋巴瘤TNM分期法:斑片期17例，斑塊期20例，腫瘤期3例。并對(duì)以上相關(guān)患者進(jìn)行隨訪，血液標(biāo)本來源于28例MF患者、13例副銀屑病患者、17例扁平苔蘚患者及10例健康對(duì)照。28例MF中，女10例，男18例；發(fā)病年齡(32.4±16.0)歲；斑片期12例，斑塊期15例，腫瘤期1例。本研究獲得杭州市第三人民醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，入選病例均簽署知情同意書。未滿18歲患兒征得其監(jiān)護(hù)人同意，并簽署知情同意書。

2.試劑:人類Treg/Th17試劑盒以及同型對(duì)照抗體均產(chǎn)自美國(guó)BD公司；佛波酯(PMA)、離子霉素(ionomycin)混合液產(chǎn)自杭州聯(lián)科公司；兔抗人叉頭狀轉(zhuǎn)錄因子P3(FOXP3)、白細(xì)胞介素(IL)17單克隆抗體(236A/E7)產(chǎn)自英國(guó)Abcam公司，即用型ChemMateEnVision兔/鼠通用型免疫組化試劑盒均產(chǎn)自丹麥Dako公司；淋巴細(xì)胞分離液產(chǎn)自美國(guó)Sigma公司；RPMI1640培養(yǎng)液產(chǎn)自美國(guó)Gibco公司；胎牛血清產(chǎn)自杭州四季青公司。

3.流式細(xì)胞儀檢測(cè)Treg、Th17細(xì)胞的百分率:采集患者肘靜脈血5 ml，肝素抗凝，2 045×g離心15 min分離血漿，貯存于-80℃冰箱中備用。將下層血細(xì)胞與磷酸鹽緩沖液(PBS)按1∶1混合，并緩慢加入4 ml淋巴細(xì)胞分離液中獲得外周血單一核細(xì)胞(PBMC)。在含有10%胎牛血清的RPMI1640 8 ml培養(yǎng)液中重懸PBMC，加入4 μl PMA/離子霉素混合物(PMA 12.5 mg/L，離子霉素 0.25 g/L)和 4 μl的BD GolgiStopTM蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)抑制劑(包含莫能霉素)，在37℃，5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5 h。離心，應(yīng)用染色緩沖液(FBS)洗滌1遍，調(diào)整細(xì)胞濃度為2×106/ml，按照Th17/TregPhenotyPing試劑盒進(jìn)行操作，上流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。

4.免疫組化EnVision法檢測(cè)FOXP3、IL-17的表達(dá):將標(biāo)本切片(3 μm厚度)，裱于防脫載物片，常規(guī)脫蠟、水化后，置pH9.0乙二胺四乙酸(EDTA)緩沖液中水浴熱修復(fù)95～98℃30 min；每張切片加1滴3%過氧化氫溶液室溫下孵育10 min；PBS沖洗，加入FOXP3、IL-17單抗37℃孵育 1 h；PBS再次沖洗滴加二抗37℃孵育30 min；增敏二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色2 min；蘇木素復(fù)染，脫水、透明、封片。扁桃體組織作為陽性對(duì)照，PBS代替一抗作為陰性對(duì)照，HE染色作組織學(xué)對(duì)照。鏡下以胞核和(或)胞質(zhì)見棕黃色或棕褐色反應(yīng)物為陽性，每張切片隨機(jī)選10個(gè)高倍(×400)視野，計(jì)算陽性細(xì)胞及淋巴細(xì)胞總數(shù)。觀察指標(biāo):陽性標(biāo)記指數(shù)(labeling index，LI)即陽性率 =(陽性表達(dá)細(xì)胞總數(shù)/該區(qū)域內(nèi)淋巴細(xì)胞總數(shù))×100%。

5.統(tǒng)計(jì)分析方法:采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析。以±s表示，各組Th17細(xì)胞、Treg細(xì)胞比較采用單因素方差分析。應(yīng)用Pearson相關(guān)分析法確定Th17細(xì)胞與Treg細(xì)胞的相關(guān)性。

結(jié) 果

1.外周血中Treg和Th17細(xì)胞的百分率:見表1。MF、副銀屑病、扁平苔蘚患者外周血Treg細(xì)胞較健康對(duì)照升高(均P＜0.05)，MF、副銀屑病患者亦高于扁平苔蘚患者(均P＜0.05)，MF患者與副銀屑病相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。MF患者外周血Th17細(xì)胞較副銀屑病、扁平苔蘚患者、健康對(duì)照升高(均P＜0.05)；副銀屑病患者Th17細(xì)胞較扁平苔蘚患者、健康對(duì)照均升高(均P＜0.05)；扁平苔蘚患者Th17細(xì)胞較健康對(duì)照升高(P＜0.05)。MF、副銀屑病患者外周血Th17/Treg細(xì)胞比率較扁平苔蘚患者、健康對(duì)照低(均P＜0.05)；MF患者與副銀屑病患者差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，扁平苔蘚患者與健康對(duì)照比較差異亦無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。斑片期、斑塊期及腫瘤期MF患者Th17細(xì)胞比例分別為(2.48±0.75)%、(2.67±0.88)%、3.76%，Treg細(xì)胞比例分別為(7.60±1.68)%、(8.16±1.45)%、9.63%，三期之間 Th17細(xì)胞(F=3.211，P＞ 0.05)、Treg細(xì)胞(F=1.983，P＞0.05)比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.組織中FOXP3和IL-17的表達(dá):見圖1，2，表 2，3。MF、副銀屑病及扁平苔蘚組織FOXP3均明顯高于健康對(duì)照皮膚組織，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P＜0.05)；MF及副銀屑病組織FOXP3較扁平苔蘚組織高(均P＜0.05)；MF組織FOXP3表達(dá)較副銀屑病差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。MF組織IL-17表達(dá)較副銀屑病、扁平苔蘚、健康對(duì)照組織升高(均P＜0.05)；副銀屑病IL-17表達(dá)較扁平苔蘚、健康對(duì)照組織升高(均P＜0.05)；扁平苔蘚IL-17表達(dá)較健康對(duì)照組織升高(P＜0.05)。另外，對(duì)于MF不同分期的研究發(fā)現(xiàn)，雖然各期差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但是隨著MF病情的進(jìn)展，F(xiàn)OXP3的表達(dá)逐漸升高，IL-17的表達(dá)在紅斑、斑塊期逐漸升高，至腫瘤期則有所下降。

表1 各組患者和健康對(duì)照外周血Th17和Treg細(xì)胞百分率比較(±s)

表1 各組患者和健康對(duì)照外周血Th17和Treg細(xì)胞百分率比較(±s)

注:a:與健康對(duì)照組比較，P ＜0.05；b:與扁平苔蘚患者比較，P ＜0.05；c:與副銀屑病患者比較，P ＜0.05

組別 例 Treg細(xì)胞(%) Th17細(xì)胞(%) Th17/Treg蕈樣肉芽腫 28 8.09±1.68ab 3.22±0.82abc 0.41±0.11ab副銀屑病 13 6.53±1.67ab 2.46±0.79ab 0.39±0.12ab扁平苔蘚 17 2.84±1.16a 1.38±0.47a 0.50±0.06健康對(duì)照 10 1.01±0.35 0.59±0.30 0.57±0.19 F值 33.24 29.97 12.03 P值 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01

圖1 免疫組化檢測(cè)皮膚組織中FOXP3的表達(dá)(×200) FOXP3分別在斑片期(1a)、斑塊期(1b)、腫瘤期(1c)蕈樣肉芽腫胞核中呈棕褐色強(qiáng)陽性表達(dá)；1d:FOXP3在大斑塊副銀屑病胞核中呈中等陽性表達(dá)；1e:FOXP3在扁平苔蘚胞核中呈弱陽性表達(dá)；1f:FOXP3在健康對(duì)照中呈陰性表達(dá)

3.外周血中Treg與Th17細(xì)胞相關(guān)性在健康對(duì)照(r=0.801，P＜ 0.05)、扁平苔蘚(r=0.969，P＜0.05)及副銀屑病(r=0.746，P＜ 0.05)中，患者外周血Treg細(xì)胞與Th17細(xì)胞的百分率呈正相關(guān)；在早期MF(斑片期/斑塊期)患者外周血中Treg細(xì)胞與Th17細(xì)胞的數(shù)量亦呈正相關(guān)，r=0.423，P＜0.05，但在腫瘤期則無相關(guān)性。

表2 各組皮膚組織中FOXP3、白細(xì)胞介素17陽性表達(dá)率比較(±s)

表2 各組皮膚組織中FOXP3、白細(xì)胞介素17陽性表達(dá)率比較(±s)

注:a:與健康對(duì)照比較，P＜0.05；b:與扁平苔蘚患者比較，P＜0.05；c:與副銀屑病患者比較，P＜0.05

組別 例 FOXP3(%) 白細(xì)胞介素17(%)蕈樣肉芽腫 40 14.94±4.46ab 15.89±4.27abc副銀屑病 13 11.95±4.72ab 12.02±3.34ab扁平苔蘚 17 6.32±2.81a 4.84±1.93a健康對(duì)照 10 3.43±1.79 2.62±0.89 F值 28.42 31.95 P值 ＜0.01 ＜0.01

表3 蕈樣肉芽腫各期FOXP3、白細(xì)胞介素17在組織中陽性表達(dá)率比較(±s)

表3 蕈樣肉芽腫各期FOXP3、白細(xì)胞介素17在組織中陽性表達(dá)率比較(±s)

組別 例 FOXP3(%) 白細(xì)胞介素17(%)斑片期 17 13.70±6.23 14.85±6.30斑塊期 20 15.53±5.26 16.34±5.35腫瘤期 3 17.57±1.32 15.58±0.96 F值 0.431 0.56 P值 ＞0.05 ＞0.05

討 論

Treg和Th17細(xì)胞在不同的細(xì)胞因子環(huán)境下分化而成，具有不同的生物學(xué)功能。研究發(fā)現(xiàn)Treg細(xì)胞和Th17細(xì)胞均參與了自身免疫性疾病、感染、腫瘤和移植排斥等疾病的發(fā)生和發(fā)展，決定了疾病的預(yù)后和轉(zhuǎn)歸，成為近來免疫學(xué)研究中的一個(gè)熱點(diǎn)。人們?cè)诔浞痔接慣reg細(xì)胞及Th17細(xì)胞各自的分化、調(diào)節(jié)機(jī)制的同時(shí)，也在尋找兩種細(xì)胞之間的相互作用在相關(guān)疾病發(fā)生發(fā)展中的變化[11]。在MF中也曾有兩種T細(xì)胞亞群的報(bào)道[12-13]，但對(duì)于Treg細(xì)胞及Th17細(xì)胞在MF各期的變化及之間相互作用尚未有研究。

我們研究發(fā)現(xiàn)，MF患者外周血中Treg、皮損中FOXP3的表達(dá)均高于副銀屑病、扁平苔蘚患者及健康對(duì)照，但MF患者與副銀屑病差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。關(guān)于副銀屑病和MF之間的確切關(guān)系目前還沒有一致的觀點(diǎn)。有研究發(fā)現(xiàn)，約61%的副銀屑病可發(fā)展為MF[11]。Burg等[12]研究結(jié)果亦顯示副銀屑病是MF的早期表現(xiàn)。我們發(fā)現(xiàn)FOXP3+Treg在MF和副銀屑病中的表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在對(duì)不同分期MF研究中發(fā)現(xiàn)，隨著疾病進(jìn)展，F(xiàn)OXP3陽性表達(dá)率逐漸升高，這種增多可能為腫瘤細(xì)胞的免疫逃逸提供條件，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。

圖2 免疫組化檢測(cè)皮膚組織中IL-17的表達(dá)(×200) IL-17分別在斑片期(2a)、斑塊期(2b)、腫瘤期(2c)蕈樣肉芽腫胞質(zhì)中呈棕褐色強(qiáng)陽性表達(dá)；2d:IL-17在大斑塊副銀屑病胞質(zhì)中呈中等陽性表達(dá)；2e:IL-17在扁平苔蘚胞質(zhì)中呈弱陽性表達(dá)；2f:IL-17在健康對(duì)照中呈陰性表達(dá)

本研究結(jié)果顯示，外周血中Th17細(xì)胞、皮損中IL-17的表達(dá)在炎癥性皮膚病、有腫瘤發(fā)展傾向的炎癥性皮膚病及MF早期中的表達(dá)有逐步增高的趨勢(shì)，這與Cirée等[13]的研究結(jié)果相似，但是，在對(duì)僅有的3例MF腫瘤期患者的研究中發(fā)現(xiàn)，IL-17、Th17細(xì)胞表達(dá)相比早期有所減少，表明其參與MF的發(fā)生、發(fā)展過程。IL-17、Th17細(xì)胞在MF進(jìn)展中到底發(fā)揮促腫瘤作用還是抗腫瘤作用，仍需要深入的研究。我們研究亦發(fā)現(xiàn)，Th17細(xì)胞和Treg細(xì)胞在健康對(duì)照、扁平苔蘚及副銀屑病患者中呈正相關(guān)，而對(duì)MF不同分期的研究發(fā)現(xiàn):Th17細(xì)胞與Treg細(xì)胞在早期MF進(jìn)展中呈正比，表明二者存在相互作用；腫瘤期MF因?yàn)闃颖玖啃。瑫簾o相關(guān)性表現(xiàn)。

因此，MF患者存在Th17/Treg細(xì)胞失衡現(xiàn)象，表明其參與了MF的發(fā)生、發(fā)展過程。這對(duì)揭示MF的發(fā)病機(jī)制提供了一種新的思路。由于本研究所包含的腫瘤期MF病例較少，Th17細(xì)胞和Treg細(xì)胞在腫瘤期MF發(fā)病過程中的相互作用有待于擴(kuò)大樣本量進(jìn)一步研究。

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2013-09-04)

(本文編輯:尚淑賢)

Association analysis between T helper type 17 cells，regulatory T cells and mycosis fungoides

Li Zhao*，Wang Ping，Hou Xiuli，Liu Dongyin，Wang Mei，Zheng Junhui.*Department of Dermatology，Third People's Hospital of Hangzhou，Hangzhou 310009，China

Wang Ping，Email：dermwang@aliyun.com

ObjectiveTo investigate the changes of T helper type 17(Thl7)cells and regulatory T(Treg)cells in different stages of mycosis fungoides.MethodsFlow cytometry was performed to determine the percentage of Treg and Th17 cells in peripheral blood from 28 patients with mycosis fungoides(MF)，13 patients with large plaque parapsoriasis(PP)，17 patients with lichen planus(LP)and 10 healthy human controls，and immunohistochemistry to detect the expressions of forkhead box protein 3(FOXP3)and interleukin(IL)-17 in tissue specimens from 40 patients with MF，13 with PP，17 with LP and 10 healthy human controls.Statistical analysis was carried out by one-way analysis of variance and Pearson correlation analysis.ResultsAs far as the percentage of Treg cells in peripheral blood was concerned，MF，PP and LP patients were significantly higher than the healthy controls(8.09% ±1.68%，6.53% ±1.67%and 2.84% ±1.16%vs.1.01% ±0.35，allP＜0.05)，PP patients were higher than LP patients and healthy controls(bothP＜ 0.05)，and LP patients were higher than healthy controls(P＜0.05).The percentage of Th17 cells in peripheral blood was significantly increased in MF patients compared with PP patients，LP patients and healthy controls(3.22% ±0.82%vs.2.46% ±0.79%，1.38% ±0.47%and 0.59% ± 0.30%，allP＜ 0.05).Elevated expression rate of FOXP3 was observed in MF，PP and LP lesions as compared with normal skin(14.94% ±4.46%，11.95% ±4.72%，6.32% ±2.81%vs.3.43% ±1.79%，allP＜ 0.05)，and in MF and PP lesions compared with LP lesions(bothP＜ 0.05)，but no significant difference was observed between MF and PP lesions(P＞0.05).There was a significant increase in the expression rate of IL-17 in MF lesions compared with PP lesions，LP lesions and normal skin(15.89% ±4.27%vs.12.02% ±3.34%，4.84% ±1.93%and 2.62% ±0.89%，allP＜0.05).The Th17/Treg ratio in peripheral blood was significantly lower in MF and PP patients than in LP patients and healthy controls(0.41±0.11 and 0.39±0.12 vs.0.50±0.06 and 0.57±0.19，allP＜ 0.05).A positive correlation was observed between the proportion of Thl7 cells and Treg cells(r=0.423，P＜ 0.05)in patients with early-stage MF，but not in those with tumor-stage MF.The proportion of Th17 cells decreased，but that of Treg cells continuously increased in patients with tumor-stage MF.However，no significant difference was noted in the proportion of Thl7 cells or Treg cells among patients with different stages of MF.ConclusionThe imbalance between Treg and Th17 cells may be involved in the occurrence and development of MF.

Mycosis fungoides；T lymphocytes，regulatory；Th17 cells

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2014.09.008

浙江省醫(yī)藥衛(wèi)生科技計(jì)劃項(xiàng)目(2014KYB200)；杭州市醫(yī)學(xué)重點(diǎn)?？茖２№?xiàng)目(20100733Q08)

310009杭州市第三人民醫(yī)院皮膚科(黎釗、王平、劉東銀、王媚、鄭俊惠)；安徽醫(yī)科大學(xué)附屬杭州臨床學(xué)院(侯秀麗)

王平，Email:dermwang@aliyun.com