殷芳 吳飛 陳佳 章楚光 宋寧?kù)o

腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞對(duì)皮膚惡性黑素瘤細(xì)胞A375生物學(xué)行為的影響

殷芳 吳飛 陳佳 章楚光 宋寧?kù)o

目的探討腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞對(duì)皮膚惡性黑素瘤細(xì)胞增殖、侵襲和遷移的影響。方法取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期人單核細(xì)胞株U937，采用佛波酯誘導(dǎo)48 h后，分為3組，Mφ組(繼續(xù)用佛波酯誘導(dǎo)48 h)、M1組(用25 mg/L LPS誘導(dǎo)48 h)、M2組(用15 μg/L IL-4誘導(dǎo)48 h)。酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測(cè)各組巨噬細(xì)胞上清中IL-12p70和IL-10表達(dá)水平。建立巨噬細(xì)胞與惡性黑素瘤A375細(xì)胞體外共培養(yǎng)體系，分別設(shè)單獨(dú)培養(yǎng)組、Mφ組(A375細(xì)胞和Mφ巨噬細(xì)胞共培養(yǎng))、M1組(A375細(xì)胞和M1型巨噬細(xì)胞共培養(yǎng))、M2組(A375細(xì)胞和M2型巨噬細(xì)胞共培養(yǎng))，分別運(yùn)用噻唑藍(lán)法、Transwell小室法觀察不同激活途徑的巨噬細(xì)胞對(duì)A375細(xì)胞增殖、侵襲、遷移等生物學(xué)行為的影響。結(jié)果增殖實(shí)驗(yàn)顯示，共培養(yǎng)48、72 h后Mφ巨噬細(xì)胞、M2型巨噬細(xì)胞顯著促進(jìn)A375細(xì)胞的增殖，M1型巨噬細(xì)胞抑制A375細(xì)胞的增殖，各處理組間兩兩比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P＜0.05)，共培養(yǎng)24 h后各組間兩兩比較A375細(xì)胞增殖率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。侵襲實(shí)驗(yàn)顯示M2組和Mφ組穿過(guò)Transwell膜的A375細(xì)胞數(shù)量(147.00±7.92、113.22±8.15)較單獨(dú)培養(yǎng)組(84.11±6.07)明顯增加(P＜0.05)，M1組穿膜細(xì)胞(56.44±7.55)明顯減少(P＜0.05)。遷移實(shí)驗(yàn)顯示M2組和Mφ組穿過(guò)Transwell膜的A375細(xì)胞數(shù)量(198.33±8.22、156.00±8.83)較單獨(dú)培養(yǎng)組(123.89±7.01)明顯增加(均P＜0.05)，M1組穿膜細(xì)胞(97.11±6.75)明顯減少(P＜0.05)。結(jié)論IL-4激活的M2型巨噬細(xì)胞對(duì)A375細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移可能起促進(jìn)作用；脂多糖激活的M1型巨噬細(xì)胞對(duì)A375細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移可能起抑制作用。佛波酯誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞更傾向于M2型巨噬細(xì)胞表型。

黑色素瘤；細(xì)胞系，腫瘤；巨噬細(xì)胞；細(xì)胞增殖；細(xì)胞運(yùn)動(dòng)

腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞(tumor-associated macrophages，TAM)是指浸潤(rùn)于腫瘤間質(zhì)中的巨噬細(xì)胞，是多數(shù)實(shí)體腫瘤組織中數(shù)量最多的炎癥細(xì)胞群，與腫瘤的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切。目前研究認(rèn)為，TAM可以影響腫瘤發(fā)生的各個(gè)環(huán)節(jié)，促進(jìn)血管生成、細(xì)胞增殖、組織重塑，抑制腫瘤免疫應(yīng)答，導(dǎo)致腫瘤的發(fā)展和轉(zhuǎn)移[1]。有報(bào)道指出，TAM對(duì)黑素瘤的生長(zhǎng)、血管生成、遠(yuǎn)處侵襲和轉(zhuǎn)移具有重要作用[2]。然而，TAM對(duì)人惡性黑素瘤細(xì)胞侵襲進(jìn)展的作用和影響目前尚不明確。本研究通過(guò)Transwell小室建立不同途徑激活的巨噬細(xì)胞與人惡性黑素瘤細(xì)胞的體外共培養(yǎng)體系，觀察巨噬細(xì)胞對(duì)人惡性黑素瘤細(xì)胞增殖、侵襲和遷移的影響。

材料與方法

1.材料:人單核細(xì)胞株U937購(gòu)自美國(guó)菌種保藏中心(ATCC)。人惡性黑素瘤細(xì)胞A375購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)。RPMI1640培養(yǎng)基、胎牛血清購(gòu)于美國(guó)Hyclone公司，青鏈霉素雙抗液及0.25%胰酶購(gòu)于美國(guó)Gibco公司，佛波酯、細(xì)菌脂多糖(LPS)、噻唑藍(lán)(MTT)粉末購(gòu)于美國(guó)Sigma公司，重組人白細(xì)胞介素4(IL-4)購(gòu)于美國(guó)Perprotech公司，人IL-10、IL-12p70 ELISA試劑盒購(gòu)于美國(guó)RD公司、matrigel基質(zhì)膠購(gòu)于美國(guó) BD 公司，0.4 μm、8 μm 濾膜孔徑的Transwell小室購(gòu)于丹麥Nunk公司，細(xì)胞固定液、細(xì)胞穿膜液購(gòu)于美國(guó)Biolegend公司。

2.細(xì)胞培養(yǎng):人惡性黑素瘤細(xì)胞A375、人單核細(xì)胞株U937，均用含10%胎牛血清的RPMI1640完全培養(yǎng)基，在37℃恒溫、5%CO2的飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

3.巨噬細(xì)胞的誘導(dǎo):取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的人單核細(xì)胞株U937細(xì)胞，以1×106/孔接種于6孔板，加入佛波酯50 μg/L，孵育48 h，誘導(dǎo)形成巨噬細(xì)胞。

4.M1型、M2型巨噬細(xì)胞的誘導(dǎo)活化:將佛波酯誘導(dǎo)48 h后的巨噬細(xì)胞分成3組，Mφ組、M1組、M2組；用滅菌的磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗細(xì)胞2次，M1組、M2組分別加入含 LPS(25 mg/L)、IL-4(15 μg/L)的RPMI1640培養(yǎng)基(含10%胎牛血清)，孵育48 h，誘導(dǎo)成為M1型、M2型巨噬細(xì)胞。Mφ組則繼續(xù)加入含佛波酯50 μg/L的RPMI1640完全培養(yǎng)基。

5.酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)IL-12p70、IL-10表達(dá)水平:分別收集Mφ組、M1組、M2組細(xì)胞培養(yǎng)上清液離心，收集上清。按照ELISA試劑說(shuō)明書進(jìn)行操作，用酶標(biāo)儀在450 nm處測(cè)定吸光度A值，檢測(cè)IL-12p70、IL-10表達(dá)水平。

6.A375細(xì)胞與巨噬細(xì)胞非接觸式共培養(yǎng)體系的建立:A375細(xì)胞胰酶消化，以1×105/ml的濃度重懸，取3塊共培養(yǎng)板，按500 μl/孔種于24孔Transwell培養(yǎng)板(濾膜孔徑0.4 μm)下層小室中孵育24 h；將不同激活途徑的巨噬細(xì)胞消化后分別收集，以5×105/ml的濃度按200 μl/孔種于上層小室。分別設(shè)單獨(dú)培養(yǎng)組、Mφ組(A375細(xì)胞和Mφ型巨噬細(xì)胞共培養(yǎng))、M1組(A375細(xì)胞和M1型巨噬細(xì)胞共培養(yǎng))、M2組(A375細(xì)胞和M2型巨噬細(xì)胞共培養(yǎng))，共培養(yǎng)24、48、72 h后進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。每組設(shè)4個(gè)復(fù)孔。

7.MTT法檢測(cè)A375細(xì)胞的增殖:共培養(yǎng)24、48、72 h后分別取出1塊培養(yǎng)板，在Transwell小室下室中加入MTT(5 g/L)，繼續(xù)孵育4 h，吸棄上清，加DMSO 400 μl/孔，振蕩10 min。在酶聯(lián)免疫測(cè)定儀上檢測(cè)各組490 nm處吸光度A值。計(jì)算細(xì)胞增殖率:增殖率(%)=(實(shí)驗(yàn)組A值-單獨(dú)培養(yǎng)組A值/單獨(dú)培養(yǎng)組A值)×100%。每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

8.Transwell小室檢測(cè)細(xì)胞侵襲能力:將Matrigel膠用無(wú)血清RPMI1640培養(yǎng)基1∶4稀釋，按60 μl/孔鋪于Transwell小室的上室面，37℃孵育過(guò)夜。所有操作均在冰上進(jìn)行。每孔加入80 μl無(wú)血清1640培養(yǎng)基，37℃孵育30 min，吸去培養(yǎng)基；將共培養(yǎng)后的A375細(xì)胞用無(wú)血清培養(yǎng)基以5×106/ml濃度按200 μl/孔接種于上層小室，下層小室加入含10%胎牛血清的完全培養(yǎng)基500 μl，繼續(xù)培養(yǎng)24 h；吸盡培養(yǎng)基，PBS清洗3次，加入4%甲醛，室溫固定20 min，PBS清洗3次；風(fēng)干后0.3%結(jié)晶紫染色20 min，PBS清洗3次；顯微鏡下觀察濾膜下表面藍(lán)紫色胞質(zhì)細(xì)胞，隨機(jī)取10個(gè)×400視野分別計(jì)數(shù)，取均值。以穿膜細(xì)胞的數(shù)目表示細(xì)胞的侵襲能力。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

9.Transwell小室檢測(cè)細(xì)胞遷移能力:實(shí)驗(yàn)步驟同侵襲實(shí)驗(yàn)，但不需鋪Matrigel膠。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

圖1 U937細(xì)胞形態(tài)(×400) 1a:未誘導(dǎo)的U937細(xì)胞呈懸浮生長(zhǎng)的葡萄串狀圓球形；1b:經(jīng)佛波酯誘導(dǎo)24 h后部分細(xì)胞已貼壁(箭頭)；1c:經(jīng)佛波酯誘導(dǎo)48 h后大部分細(xì)胞變?yōu)橘N壁良好，且有偽足伸出，呈長(zhǎng)梭形(箭頭)；1d:經(jīng)佛波酯誘導(dǎo)72 h后細(xì)胞大量偽足伸出(箭頭)；1e:經(jīng)佛波酯誘導(dǎo)96 h后細(xì)胞大量偽足伸出(箭頭)

結(jié) 果

1.佛波酯對(duì)單核細(xì)胞形態(tài)的影響:未經(jīng)佛波酯誘導(dǎo)的人單核細(xì)胞株U937呈懸浮生長(zhǎng)的葡萄串狀圓球形(圖1a)，經(jīng)佛波酯誘導(dǎo)24 h后部分細(xì)胞已貼壁(圖1b)，48 h后大部分變?yōu)橘N壁生長(zhǎng)，貼壁良好，且有偽足伸出，呈長(zhǎng)梭形，具備巨噬細(xì)胞形態(tài)(圖1c)。佛波酯繼續(xù)誘導(dǎo)48 h用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)(圖 1d，1e)。

2.經(jīng)LPS及IL-4激活后的巨噬細(xì)胞分別高表達(dá)IL-12p70、IL-10:LPS激活后的巨噬細(xì)胞 IL-12p70分泌水平[(13.34±0.71)ng/L)]較佛波酯單獨(dú)誘導(dǎo)[(8.59±0.37)ng/L]及IL-4激活后的巨噬細(xì)胞[(7.15±0.78)ng/L]顯著提高；IL-4激活[(1 959.59±140.53)ng/L]及佛波酯單獨(dú)誘導(dǎo)[(1 352.25±151.08)ng/L]的巨噬細(xì)胞IL-10分泌水平較LPS激活的巨噬細(xì)胞[(186.13±21.03，ng/L]顯著提高；佛波酯誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞IL-12p70、IL-10的分泌水平與M2型巨噬細(xì)胞更為接近，也表現(xiàn)為高水平的IL-10、低水平的IL-12p70。

3.不同途徑激活的巨噬細(xì)胞對(duì)A375細(xì)胞增殖的影響:與A375細(xì)胞共培養(yǎng)24 h后，不同處理組間兩兩比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，但共培養(yǎng)48、72 h后各處理組間兩兩比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P＜0.05)。見(jiàn)表1。

4.不同途徑激活的巨噬細(xì)胞對(duì)A375細(xì)胞侵襲力的影響:M2型巨噬細(xì)胞組(147.00±7.92)和Mφ巨噬細(xì)胞組(13.22±8.15)穿過(guò)Transwell膜的A375細(xì)胞數(shù)量較單獨(dú)培養(yǎng)組明顯增加，M1型巨噬細(xì)胞組穿過(guò)Transwell膜的A375細(xì)胞數(shù)量較單獨(dú)培養(yǎng)組明顯減少，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P＜0.05)。

5.不同途徑激活的巨噬細(xì)胞對(duì)A375細(xì)胞遷移力的影響:M2組和Mφ組穿過(guò)Transwell膜的A375細(xì)胞數(shù)量較單獨(dú)培養(yǎng)組明顯增加，M1組較單獨(dú)培養(yǎng)組明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P＜0.05)。見(jiàn)表2。

討 論

表1 不同途徑激活的巨噬細(xì)胞對(duì)A375細(xì)胞增殖率的影響(%，±s)

表1 不同途徑激活的巨噬細(xì)胞對(duì)A375細(xì)胞增殖率的影響(%，±s)

注:n=3。Mφ組:A375細(xì)胞和佛波酯單獨(dú)誘導(dǎo)形成的Mφ型巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)；M1組:A375細(xì)胞與佛波酯和LPS誘導(dǎo)形成的M1型巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)，M2組:A375細(xì)胞與佛波酯和IL-4誘導(dǎo)形成的M2型巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)。各處理組組內(nèi)不同時(shí)間點(diǎn)兩兩比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P＜0.05)，各時(shí)間點(diǎn)不同處理組組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P＜0.05)

不同處理組 24 h 48 h 72 h Mφ組 11.88±3.60 16.85±3.36 20.98±0.87 M1組 -21.95±4.26 -36.58±1.87 -40.52±0.75 M2組 13.07±6.57 23.66±3.48 35.80±2.24

根據(jù)巨噬細(xì)胞激活途徑及激活后作用的不同將其分為兩類[3]:經(jīng)干擾素γ(INF-γ)及細(xì)菌LPS等激活的巨噬細(xì)胞稱為經(jīng)典激活的巨噬細(xì)胞(classical activated macrophage， caMφ 或 M1)，為一類“抑癌細(xì)胞”；經(jīng)IL-4、IL-13等激活的巨噬細(xì)胞稱為替代激活的巨噬細(xì)胞(alternative activated macrophage，aaMφ或M2)，為一類“促癌細(xì)胞”。佛波酯誘導(dǎo)的人單核細(xì)胞系U937是巨噬細(xì)胞樣細(xì)胞，通常作為人巨噬細(xì)胞的模型，用于很多體外試驗(yàn)[4]。研究證實(shí)，IL-12和IL-10的表達(dá)水平可用來(lái)區(qū)分M1型、M2型巨噬細(xì)胞，目前已被大量研究采用[5]。由LPS誘導(dǎo)激活的巨噬細(xì)胞表達(dá)高水平IL-12、低水平IL-10，表現(xiàn)為M1型巨噬細(xì)胞的表型[6]，而由IL-4誘導(dǎo)激活的巨噬細(xì)胞表達(dá)低水平IL-12、高水平IL-10，表現(xiàn)為M2型巨噬細(xì)胞的表型[7]。因而IL-12、IL-10的表達(dá)水平是區(qū)分M1型、M2型巨噬細(xì)胞的一個(gè)方法。

表2 不同激活途徑的巨噬細(xì)胞對(duì)A375細(xì)胞侵襲力和遷移力的影響(%，±s)

表2 不同激活途徑的巨噬細(xì)胞對(duì)A375細(xì)胞侵襲力和遷移力的影響(%，±s)

注:n=3。a:各組間兩兩比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，均P＜0.01。Mφ組:A375細(xì)胞和佛波酯單獨(dú)誘導(dǎo)形成的Mφ型巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)；M1組:A375細(xì)胞與佛波酯和脂多糖誘導(dǎo)形成的M1型巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)；M2組:A375細(xì)胞與佛波酯和白細(xì)胞介素4誘導(dǎo)形成的M2型巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)

處理組 穿膜細(xì)胞數(shù)(侵襲試驗(yàn)) 穿膜細(xì)胞數(shù)(遷移試驗(yàn))單獨(dú)培養(yǎng)組 84.11±6.07 123.89±7.01 Mφ組 113.22±8.15 156.00±8.83 M1組 56.44±7.55 97.11±6.75 M2組 147.00±7.92 198.33±8.22 F值 243.85 284.69 P值 ＜0.01a ＜0.01a

我們?cè)隗w外用佛波酯誘導(dǎo)單核細(xì)胞株U937成巨噬細(xì)胞；用LPS激活成M1型巨噬細(xì)胞，ELISA檢測(cè)顯示表達(dá)高水平的IL-12p70、低水平的IL-10；用IL-4激活成M2型巨噬細(xì)胞，ELISA檢測(cè)顯示其表達(dá)低水平IL-12p70、高水平IL-10。說(shuō)明機(jī)體在疾病條件下，如腫瘤過(guò)程中可存在不同類型的巨噬細(xì)胞，這些不同類型的巨噬細(xì)胞發(fā)揮著不同的功能，可能對(duì)腫瘤的發(fā)生和發(fā)展起著不同的調(diào)節(jié)作用。另外，在實(shí)驗(yàn)中我們還發(fā)現(xiàn)，佛波酯誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞IL-12p70、IL-10的分泌水平與M2型巨噬細(xì)胞更為接近，表現(xiàn)為高水平表達(dá)IL-10、低水平表達(dá)IL-12p70。

目前大多數(shù)觀點(diǎn)認(rèn)為腫瘤組織中浸潤(rùn)的巨噬細(xì)胞即TAM主要表現(xiàn)為M2巨噬細(xì)胞表現(xiàn)型，是腫瘤組織中占優(yōu)勢(shì)支配地位的巨噬細(xì)胞的表型，可通過(guò)細(xì)胞因子、趨化因子、生長(zhǎng)因子、基質(zhì)金屬蛋白酶的表達(dá)促進(jìn)新生血管的生成、轉(zhuǎn)移，抑制適應(yīng)性免疫[8]，發(fā)揮促癌作用，已在肝細(xì)胞癌、肺癌、乳腺癌中被證實(shí)[8-10]。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)Transwell小室將不同途徑激活的巨噬細(xì)胞與人惡性黑素瘤A375細(xì)胞進(jìn)行體外共培養(yǎng)，建立共培養(yǎng)體系，模擬惡性黑素瘤局部巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)微環(huán)境，觀察不同途徑激活的巨噬細(xì)胞對(duì)人惡性黑素瘤A375細(xì)胞增殖、侵襲和遷移的影響。我們發(fā)現(xiàn):①IL-4激活的M2型巨噬細(xì)胞促進(jìn)A375細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移，LPS激活的M1型巨噬細(xì)胞抑制A375細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移；②佛波酯誘導(dǎo)的Mφ巨噬細(xì)胞更傾向于M2型巨噬細(xì)胞的表型，對(duì)A375細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移起促進(jìn)作用。通過(guò)以上研究結(jié)果，我們可以進(jìn)一步推測(cè)，人惡性黑素瘤組織中浸潤(rùn)的巨噬細(xì)胞即TAM可能主要表現(xiàn)為M2巨噬細(xì)胞表現(xiàn)型，對(duì)腫瘤的發(fā)生和發(fā)展起一定的促進(jìn)作用。

有研究發(fā)現(xiàn)，巨噬細(xì)胞可隨著在腫瘤微環(huán)境中所接觸到的細(xì)胞因子的不同(Th1或Th2細(xì)胞因子)，實(shí)現(xiàn)M1型向M2型或M2型向M1型巨噬細(xì)胞的轉(zhuǎn)化，從而對(duì)腫瘤起促進(jìn)或抑制的不同作用[11]。有研究指出在腫瘤發(fā)病的開(kāi)始階段主要是M1型巨噬細(xì)胞被激活，隨后M1型巨噬細(xì)胞向M2型巨噬細(xì)胞即TAM轉(zhuǎn)化[12]，促進(jìn)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、侵襲和轉(zhuǎn)移。我們推測(cè):①TAM在皮膚惡性黑素瘤組織中可能主要是以替代激活的M2型巨噬細(xì)胞表型存在，對(duì)皮膚惡性黑素瘤的發(fā)生、發(fā)展、侵襲和轉(zhuǎn)移起促進(jìn)作用，是導(dǎo)致其預(yù)后不佳的重要因素；②巨噬細(xì)胞的異質(zhì)性和可塑性為我們有效治療皮膚惡性黑素瘤提供了一個(gè)可能的治療靶點(diǎn)，直接抑制腫瘤組織中巨噬細(xì)胞向M2型巨噬細(xì)胞即TAM轉(zhuǎn)化，通過(guò)相關(guān)途徑誘導(dǎo)TAM向M1型巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)化，有效地控制和治療皮膚惡性黑素瘤。究竟TAM如何對(duì)皮膚惡性黑素瘤細(xì)胞生物學(xué)行為產(chǎn)生影響，又有哪些可能的相關(guān)因素參與其作用過(guò)程，目前尚不清楚，值得進(jìn)一步研究。

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2013-09-10)

(本文編輯:尚淑賢)

Effects of tumor-associated macrophages on the biological behavior of A375 human malignant melanoma cells

Yin Fang*，Wu Fei，Chen Jia，Zhang Chuguang，Song Ningjing.*Shanghai Skin Disease Hospital，Anhui Medical University，Shanghai 200443，China

Song Ningjing，Email：songnj-10@163.com

ObjectiveTo evaluate the effects of tumor-associated macrophages on the proliferation，invasion and migration of human cutaneous malignant melanoma cells.MethodsCultured U937 human monocytic cells at logarithmic phase were classified into three groups to be pretreated with phorbol ester for 48 hours followed by 48-hour activation by phorbol ester(Mφ polarization)，lipopolysaccharide(LPS)at 25 mg/L(M1 polarization)，and interleukin(IL)-4 at 15 μg/L(M2 polarization)respectively.Then，enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA)was performed to determine the levels of IL-12p70 and IL-10 in the supernatant of these activated cells.A375 human malignant melanoma cells were divided into four groups to be cultured alone or with Mφ-，M1-and M2-polarized macrophages respectively.After additional culture for different durations(24，48 and 72 hours)，methyl thiazolyl tetrazolium(MTT)assay was conducted to estimate the proliferative activity，and Transwell assay to evaluate the invasion and migration activity，of the A375 cells.ResultsThe proliferation of A375 cells was accelerated by coculture with Mφ-and M2-polarized macrophages，but inhibited by that with M1-polarized macrophages，with significant differences among the four groups in the proliferative activity at 48 and 72 hours(allP＜0.05)，but not at 24 hours(P＞0.05).Invasion assay showed that the number of A375 cells that migrated through Transwell chambers was significantly larger in M2 and Mφ groups(147.00±7.92 and 113.22±8.15 respectively)，but smaller in the M1 group(56.44 ± 7.55)，than in the control group(84.11 ± 6.07，allP＜ 0.05).Similarly，migration assay revealed a significant increase in the number of A375 cells that migrated through Transwell chambers in the M2 and Mφ groups(198.33±8.22 and 156.00±8.83 respectively)，but a significant decrease in the M1 group(97.11±6.75)as compared with the control group(123.89±7.01，allP＜0.05).Conclusions The proliferation，invasion and migration of A375 cells can be accelerated by IL-4-activated M2-polarized macrophages，but decelerated by LPS-activated M1-polarized macrophages.Phorbol ester tends to induce monocytic cells to differentiate into M2-polarized macrophages.

Melanoma；Cell line，tumor；Macrophages；Cell proliferation；Cell movement

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2014.09.003

上海市自然科學(xué)基金(11ZR1432900)；上海市衛(wèi)生局科研項(xiàng)目(20114125)

200443上海市皮膚病醫(yī)院(殷芳、陳佳、章楚光、宋寧?kù)o)；安徽醫(yī)科大學(xué)上海皮膚病臨床學(xué)院(吳飛)

宋寧?kù)o，Email:songnj-10@163.com